腺病毒adv-hmepe質粒構建與轉染表達優化

張慧明　魏　巍　劉　爽

(佳木斯大學，黑龍江　佳木斯　154002)

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腺病毒adv-hmepe質粒構建與轉染表達優化

張慧明魏巍劉爽

(佳木斯大學，黑龍江佳木斯154002)

目的構建人細胞外基質磷酸糖蛋白(hmepe)基因的重組腺病毒pYr-ads-4-hMEPE真核表達載體，并優化其轉染條件。方法構建腺病毒包裝質粒pYr-ads-4-hMEPE，在HEK293細胞中包裝形成腺病毒顆粒，轉染前列腺上皮細胞株RWPE1，同時轉染空質粒作為對照細胞株。設置腺病毒重組質粒梯度檢測最佳轉染濃度，免疫印跡檢測轉染細胞株中MEPE蛋白表達水平，確定轉染效果。共聚焦顯微鏡檢測不同條件下的轉化率。結果經酶切與測序驗證，pYr-ads-4-hMEPE重組質粒構建成功，免疫印跡分析驗證轉染rAd-4-hMEPE的RWPE1細胞株中MEPE蛋白表達水平上調，而轉染相應空載體的細胞株中MEPE蛋白的表達水平與野生型細胞株一致，說明腺病毒質粒構建成功可在真核細胞表達，共聚焦檢測分析質粒濃度對轉染效率可信度較好。結論成功構建hmepe真核表達載體，重組腺病毒轉染RWPE1細胞最佳融合比例1.25∶1 000，即質粒量為1.25 μl加入1 ml培養液中轉染效率最佳。

腺病毒；轉染；優化

病毒載體作為基因治療技術的手段被廣泛應用〔1〕，通過對病毒基因組的改造，使之能夠攜帶外源目的基因和相關的病毒元件，并被包裝成病毒顆粒。病毒轉染宿主細胞，使攜帶的外源基因在宿主體內表達〔2〕，其中腺病毒質粒是常用的真核表達載體。腺病毒不會將外源基因插入目的基因組，雖不能長期穩定表達，只能瞬時轉染，但操作安全性優于慢病毒，因此廣泛應用于實驗研究。通常腺病毒轉染效率較高并可以轉染任何細胞株，但實際應用中需要優化條件，以達到最佳轉染結果且減少病毒使用量，增加安全性〔3〕。本實驗構建了腺病毒人細胞外基質磷酸糖蛋白(hmepe)真核表達質粒，并研究其最佳轉染條件，為研究MEPE在前列腺癌細胞中的功能奠定實驗基礎。

1　材料與方法

1.1材料前列腺上皮細胞RWPE1、人胚腎細胞NHK293購自中國科學院上海細胞所；大腸桿菌DH5α感受態細胞實驗室保存；表達克隆載體pYr-adshuttle-4以及Adenovirus Expression System重組腺病毒構建體系均購自長沙贏潤生物技術有限公司；PCR酶、限制性內切酶購自Takara公司；T4 DNA Ligase購自NEB公司；Marker Ⅳ購自長沙贏潤生物技術有限公司；質粒小提試劑盒、膠回收試劑盒，普瑞麥格生物技術有限公司自產；其他常規試劑均為國產；引物合成、測序均在上海英駿生物技術有限公司完成；細胞培養常用材料與耗材等。

1.2方法

1.2.1構建pYr-ads-4-hMEPE質粒本實驗室保存人MEPE蛋白的cDNA序列質粒，PCR擴增。上游引物PRIMER1：GTG AAT AAA GAA TAT AGT ATC AGT；下游引物PRIMER2：CTA GTC ACC ATC GCT CTC ACT。PCR反應條件：94℃ 5 min，94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 1 min 40 s，72℃ 7 min，30個循環。膠回收試劑盒回收PCR產物。質粒pYr-adshuttle-4載體和插入片段hmepe分別用NheⅠ、HindⅢ雙酶切。酶切產物連接后轉化DH5α感受態細胞，選1～2陽性克隆酶切測序鑒定。

1.2.2構建腺病毒質粒并轉染細胞取pYr-ads-4-mMEPE 3 μl、pAd/PL-DEST(0.25 μg/μl)0.5 μl、LR Clonase Ⅱ 2 μl，25℃，1 h。加入蛋白酶K 1 μl，37℃，15 min得重組腺病毒質粒。用PacⅠ酶切重組腺病毒質粒，37℃水浴反應3 h。酶切后產物中加70 μl TE緩沖液(pH 8.0)及100 μl酚、氯仿、異戊醇的混合物，混勻。15 000 r/min離心5 min，取上清至干凈的1.5 ml EP管中。加入3 mol/L乙酸鈉(NaOAc) 10 μl，混勻，加入350 μl 無水乙醇，混勻。-80℃冷凍15 min，15 000 r/min離心15 min。70%酒精洗滌2遍，用10 μl H2O充分溶解。使用 METAFECTENETM(Biontex公司) lipid，將DNA與lipid融合，對指數生長期HEK 293細胞進行轉染。24 h后，換培養基為10%胎牛血清(FBS)的完全培養基。轉染3 d，每天觀察細胞病態反應(CPE)，>50%細胞脫壁時即收細胞進行裂解收病毒。測定病毒滴度為TCID50=10-4.2/100 μl 病毒。

1.2.3病毒質粒轉染細胞鑒定取指數生長期細胞RWPE1接種于6孔培養板中，分別鋪3個復孔，37℃培養過夜后轉染腺病毒質粒，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，加入無血清培養基病毒顆粒混合液，1 ml無血清培養基中分別加入0.5、1.25、2.5、3.75、5 μl病毒質粒，轉染6 h后換為正常培養基，24 h后得到轉染的細胞，4%多聚甲醛固定，4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核，激光共聚焦顯微鏡觀察。隨機選取10個視野，每個視野下確定DAPI染色的細胞總數，然后確定MEPE高表達的激發綠色熒光的細胞數。計算轉染效率。轉染率=綠色熒光細胞(個)/藍色細胞核(個)×100%。

1.2.4免疫印跡檢測MEPE蛋白在轉染細胞株中表達情況取指數生長期RWPE1細胞，按1.2.3步驟操作，種板、轉染，離心收集細胞，裂解細胞抽提蛋白。然后加入等體積的2×上樣緩沖液，煮沸10 min，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，電泳轉膜后用5%脫脂奶封閉1 h，一抗室溫結合1 h，洗膜后，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，室溫結合1 h，洗膜后加增強化學發光法(ECL)顯色液作用3 min，壓片顯影。

2　結　果

2.1經酶切與測序驗證pYr-ads-4-mMEPE重組質粒構建成功，載體7 015 bp,目的片段1 575 bp。見圖1。

2.2腺病毒重組質粒與細胞液的比例對轉染率的影響不同質粒的量分別加入1 ml細胞培養液中，隨著加入質粒量的升高，轉染率逐漸增大，1.25 μl時轉染效率最佳，增加病毒量轉染率無明顯變化；但達到5 μl時細胞大量死亡。見圖2，表1。

圖1　酶切驗證質粒構建pYr-ads-4-mMEPE瓊脂糖電泳圖

圖2　共聚焦檢測腺病毒重組質粒轉染效率

2.3免疫印跡檢測轉染rAd-4-hMEPE的RWPE1細胞株蛋白表達水平轉染相應空載體的細胞株中MEPE蛋白表達水平與野生型細胞株一致，說明腺病毒質粒構建成功并可在真核細胞表達。隨著質粒量的不同，轉染效率不同；質粒0.5 μl時轉染率較低，1.25 μl時較高，隨后增加質粒的量轉染效率無顯著性差異。成功構建hmepe真核表達載體，重組質粒的量為1.25 μl時轉化率最佳。見圖3。

圖3　Western印跡檢測各個細胞株中MEPE蛋白表達趨勢

表1　不同腺病毒重組質粒量對細胞轉染效率的影響±s)

3　討　論

前列腺癌是老年男性常見的惡性腫瘤，是男性發病率較高的癌癥之一〔4〕。前列腺癌發病隱匿，早期易發生骨轉移，給診斷與根治帶來困難，患者常以骨轉移癥狀為首次就診原因。MEPE蛋白作為分泌蛋白分布在細胞外基質中，含有多個磷酸化位點，具有類胰島素因子的活性〔5〕，與成骨性骨轉移有關，但因轉染表達效率低影響對MEPE蛋白功能的研究。

腺病毒載體的特點是宿主范圍廣，對人致病性低，在增殖和非增殖細胞中感染和表達基因，能有效進行增殖，滴度高，可以通過不同的途徑感染所有細胞類型，不整合到染色體中，無插入致突變性，不會影響目的基因的長期表達，能在懸浮培養液中擴增，相對穩定易于濃縮與純化，能同時表達多個基因，這些優勢使腺病毒成為外源基因轉染機體細胞的表達載體，廣泛應用于各種基因治療。但是，作為載體腺病毒還有許多不足之處，細胞會產生免疫性反應，使重復感染失效〔6〕；另外，其毒性較大，用作轉染細胞實驗時需要對其毒性進行檢測〔7〕。

本實驗在RWPE1細胞株用rAD-4-hMEPE重組質粒瞬時轉染，隨著重組質粒的提高，轉染率逐漸增大，當量為1.25 μl時轉染率最佳，隨后細胞出現CPE現象，轉染率下降，細胞形態發生變化。可見轉染質粒量不可以過大，細胞會因毒性太大而脫落。免疫印跡結果表明，轉染rAd-4-hMEPE的RWPE1細胞株上調MEPE蛋白表達，生長形態良好。重組質粒構建成功，可在真核細胞內表達，當質粒量達到1.25 μl時轉染效率明顯增高，繼續增加質粒量轉染效率沒有太大變化。成功構建hmepe真核表達質粒是研究前列腺癌骨轉移的前期試驗，MEPE 表達可對惡性腫瘤的發生、轉移做出預測，為惡性腫瘤基因治療奠定基礎。而且，檢測MEPE的表達水平還可監測腫瘤治療的預后，為腫瘤基因治療提供新的靶點。

1Wu TL，Zhou DM.Viral delivery for gene therapy against cell movement in cancer〔J〕.Adv Drug Deliv Rev，2011；63(8)：671-7.

2Miller AD.Cationic liposome systems in gene therapy〔J〕.Drugs，1998;1(5)：574-83.

3Barouch DH，Alter G,Broge T,etal.Protective efficacy of adenovirus-protein vaccines against SⅣ challenges in rhesus monkeys〔J〕.Science，2015；349(6245)：320-4.

4Arterburn D，Wellman R，Westorook ED,etal.Decision aids for benign prostatic hyperplasia and prostate cancer〔J〕.Am J Manag Care，2015；21(2)：e130-40.

5Wilmott RW，Amin RS，Perez CR，etal.Safety of adenovirus-mediated transfer of the human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator cDNA to the lungs of nonhuman primates〔J〕.Hum Gene Ther，1996；7(3)：301-18.

6Landin AM，Kim JW，Chaudhari N.Liposome-mediated transfection of mature taste cells(J).J Neurobiol，2005；65(1)：12-21.

7Drezner MK，Quarles LD，Mundy GR.MEPE has the properties of an osteoblastic phosphatonin and minhibin〔J〕.Bone，2004；34(2)：303-19.

〔2016-05-09修回〕

(編輯袁左鳴)

國家自然科學基金資助項目(No.31471213)；黑龍江省自然科學基金資助項目(No.D201208)；佳木斯大學科學技術重點項目(No.Sz2013-003)；佳木斯大學研究生科技創新項目理科面上 (No.LM2014_002)

劉爽 (1975-)，女，博士，碩士生導師，主要從事腫瘤轉移機制研究。

張慧明(1981-)，女，碩士，主要從事腫瘤轉移機制研究。

R735.7

A

1005-9202(2016)16-3901-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.014