鹿角膠對腦缺血大鼠腦組織的保護作用及機制

李　輝　陳俊宇　楊　擎　張慧媛　林嘉楠　劉英娜　黃連弟　黃　迪　李俊瑋　趙本正　李　娜

(吉林省前衛醫院，吉林　長春　130012)

?

鹿角膠對腦缺血大鼠腦組織的保護作用及機制

李輝陳俊宇1楊擎2張慧媛2林嘉楠2劉英娜2黃連弟1黃迪1李俊瑋1趙本正1李娜2

(吉林省前衛醫院，吉林長春130012)

目的觀察鹿角膠對大鼠腦缺血損傷的保護作用，并探討其作用機制。方法40只Wistar大鼠隨機分為空白組、模型組、低劑量組和高劑量組。線栓法制備大鼠腦缺血模型。采用行為學評分評價大鼠腦缺血程度，大腦TTC染色觀察梗死面積，HE染色觀察組織結構變化，比色法檢測大鼠血清中相關過氧化物水平。結果與模型組比較，鹿角膠給藥組腦缺血程度明顯減輕，梗死面積減小，神經元胞體腫脹減輕，乳酸脫氫酶(LDH)和丙二醛(MDA)水平下降(P<0.05)，總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)及過氧化氫酶(CAT)的活力增強。結論局部腦缺血導致腦梗死過程中，鹿角膠可通過清除腦組織缺血損傷過程中產生的氧自由基，進而達到保護腦組織的目的。

腦缺血；鹿角膠；氧化損傷

腦血管疾病中，缺血性腦血管病占80%以上，大腦中動脈閉塞(MCAO)占血管閉塞的43%。因此，針對MCAO的研究顯得尤為重要〔1〕。腦血管發生部分或者全部阻塞后，導致相應供應區的腦組織供血不足，腦細胞缺血缺氧產生大量氧自由基，導致細胞發生氧化應激損傷〔2〕。鹿角膠由鹿科動物梅花鹿(Cevus Nippon Temininck)或馬鹿(C.ela Phus L)的角煎熬而成，始載于《神農本草經》，稱“白膠”，在《本草逢原》中稱鹿膠，現稱鹿角膠。中醫醫書中記載鹿角膠針對消腫、益腎、治瘡瘍腫毒、痕血作痛、虛勞內傷、腰脊疼痛等具有很好的療效〔3〕。現代醫學報道，鹿角膠成分多樣，包含膠質25%、磷酸鈣50%～60%以及少量雌酮，另含有多種氨基酸，包括色氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、精氨酸等，還含有硫酸軟骨素A、激素、膽堿樣物質及多種微量元素〔4〕。鹿角膠所含物質的多樣性決定了其對人體具有廣泛的藥用價值，據文獻報道，中醫涉及鹿茸的方劑有852個，統計相關文獻結果顯示，其主要功效包括壯腎陽、益精血、強筋骨、駐顏悅色、益氣養神等〔5〕，而鹿角膠對腦缺血再灌注損傷的作用仍需進一步研究。

1　材料與方法

1.1主要試劑鹿角膠(河南輔仁堂制藥有限公司，批注文號：國藥準字Z41021998)；乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)含量，總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和過氧化氫酶(CAT)活力檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。

1.2動物分組及模型制備將40只大鼠分為：①空白組，通過灌胃法給等量的鹽水；②模型組，用線栓法阻斷左側頸總動脈，制備大鼠MCAO腦缺血模型；③鹿角膠低劑量組，造模前1 w灌胃給予大鼠鹿角膠溶液0.3 g/kg，1次/d，1次/d，之后再進行造模，簡稱低劑量組；④鹿角膠高劑量組，造模前1 w灌胃給予大鼠鹿角膠溶液0.6 g/kg，之后再進行造模，簡稱高劑量組。

參照文獻〔6〕方法制備大鼠局灶性腦缺血模型。用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠固定于手術臺上，切開右側頸部皮膚分離并結扎頸外動脈，自右側頸總動脈剪口將3 cm的尼龍線(末端燒成圓形，直徑約0.25 mm)自切口插入，進入頸內動脈約18 mm直至有輕微阻力為止，固定尼龍線并縫合皮膚。術后 37℃保溫，待動物蘇醒后通過神經功能學評分判定模型是否制備成功。

神經功能學評分的標準〔7〕：0分，無神經功能缺失癥狀；1分，提尾時損傷對側前肢屈曲；2分，前肢屈曲對側抵抗推力下降；3分，向對側轉圈；4分，向對側轉圈及意識障礙。評分在 2 分以上為造模成功。

1.3形態學觀察模型制備成功后，麻醉狀態下腹主動脈取血，吸入麻醉處死動物。大腦TTC染色觀察梗死面積。10%甲醛固定，石蠟包埋，病理切片HE染色觀察形態學變化。

1.4血清學檢測取血液3 000 r/min離心10 min，收集血清。檢測血清中LDH和MDA含量，T-SOD活力、GSH-PX活力和CAT活力。

1.5統計學處理采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2　結　果

2.1行為學評分空白組大鼠精神正常，四肢及行走步態均正常，評分為0。模型組大鼠出現不同程度的精神萎靡，提尾對側前肢不能伸展，行走向對側傾倒或者不同程度旋轉，綜合評分為(3.5±0.4)分，大鼠模型制備成功。低劑量組和高劑量組的神經學評分分別為(2.8±0.3)分和(2.1±0.3)分，與模型組相比均明顯降低(P<0.05)。

2.2腦梗死面積空白組腦組織無梗死區。模型組梗死區域占整個腦組織的16.4%±4.5%；低劑量組梗死區約占整個腦組織的12.1%±3.7%；而高劑量組梗死區明顯減小，約占整個腦組織的8.6%±2.3%。

2.3HE染色結果空白組海馬層次、結構清晰，細胞排列整齊、緊密；神經元形態完整，胞核染色清晰，核圓形或橢圓形、核仁明顯。模型組海馬結構層次紊亂，細胞排列稀疏；細胞周圍間隙增寬；部分神經元變性壞死，細胞質與細胞核界限模糊，核固不規則形，核仁不明顯，部分細胞核淡染及空泡化。灌胃給鹿角膠的兩組顯示海馬區細胞排列較整齊，神經元胞體腫脹減輕，病理改變均有不同程度的改善。見圖1。

2.4血清酶學檢測結果與空白組比較，模型組中LDH和MDA含量明顯升高(P<0.05)，鹿角膠給藥組的LDH和MDA含量均低于模型組(P<0.05)，其中以高劑量組最明顯(P<0.05)。與空白組比較，模型組中CAT、T-SOD以及GSH-PX活力明顯較低(P<0.01)，與模型組相比，低劑量組和高劑量組的CAT、T-SOD及GSH-PX活力明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)，見表1。

圖1　各組大鼠腦組織HE染色結果

組別LDH(U/L)CAT(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)GSH-PX活性T-SOD(U/mgprot)空白組1134.02±169.542.15±0.114.90±0.12556.08±23.4457.06±2.53模型組3976.56±169.561)1.51±0.241)10.17±0.241)317.97±9.631)51.82±1.711)低劑量組1544.90±70.152)2.53±0.072)3.20±0.562)721.83±8.82)77.23±0.532)高劑量組1639.84±162.123)3.54±0.853)4.96±1.203)767.10±14.373)78.53±0.953)

與空白組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05，3)P<0.01

3　討　論

本研究通過線栓法制備腦缺血大鼠模型，行為學評分結果顯示模型組評分顯著高于空白組，說明模型制備成功，而鹿角膠給藥組的評分明顯低于模型組，提示鹿角膠對腦缺血具有一定的保護作用。腦組織TTC染色和HE染色結果顯示，與模型組比較，鹿角膠給藥組腦組織梗死面積減小，細胞排列整齊，病理改變減輕，進一步證實鹿角膠對腦缺血的保護作用。

腦缺血發生后，氧自由基貫穿于腦組織損傷的多個環節，患者發生腦缺血后也使用相應的清除氧自由基的藥物〔8〕。很多中草藥對腦缺血具有良好的治療作用，如芹菜素、葛根素、甘草酸二銨和梓醇等〔9～12〕。研究表明，中藥對腦缺血損傷發揮保護作用的機制主要為清除自由基，減輕細胞內鈣超載及興奮性氨基酸的神經毒性，抑制細胞凋亡，阻止炎性反應等〔13,14〕。

LDH是一種糖酵解酶，存在于細胞質內，當組織發生病變和損傷時，細胞破裂，細胞質中的LDH釋放入血，血液中LDH升高，通過檢測血清中LDH的含量可評價組織的損傷程度。本研究結果顯示，模型組LDH含量高于空白組，低劑量、高劑量組LDH含量均低于模型組，表明大鼠發生腦缺血過程中鹿角膠可以降低腦組織損傷的程度。

腦組織缺血缺氧后通過酶系統和非酶系統產生氧自由基，攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化后，使MDA等脂質過氧化物水平上升，所以血清中MDA可以間接反映組織細胞損傷程度。本研究結果提示大腦發生缺血缺氧時，鹿角膠在一定程度可以通過抗脂質過氧化保護腦組織。SOD、GSH-PX和CAT水平的高低可間接反映機體清除氧自由基的能力。本文結果顯示，模型組抗氧化酶活性明顯降低，而鹿角膠處理組大鼠血清中抗氧化酶活性明顯高于模型組，提示鹿角膠對腦組織保護作用的機制之一是通過抗氧化途徑。

綜上，鹿角膠具有明顯的腦組織保護作用，其機制之一是降低由于腦缺血產生的氧自由基，提高氧自由基清除率，從而減輕腦組織損傷。鹿角膠是否還通過其他途徑對腦組織產生保護作用仍需進一步研究。

1李金國，白波.線栓法制備大鼠局灶性腦缺血模型的研究〔J〕.泰山醫學院學報，2008；29(4)：308-12.

2陳娜.腦缺血再灌注損傷神經保護策略研究〔D〕.北京：中國人民解放軍軍事醫學科學院，2012.

3彭如枝.鹿角與鹿角膠〔J〕.明膠科學與技術，1994；14(4)：195-8.

4蒙海燕.鹿茸及鹿角膠主要傳統功效作用機理研究〔D〕.長春：長春中醫藥大學，2008.

5陳富軍，白克杰，方玉先，等.略述鹿角膠的臨床應用及現代研究〔J〕.光明中醫，2002；17(5)：50-1.

6王炳高，袁新顏，王守彪，等.線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型的改進〔J〕.青島大學醫學院學報，2005；41(1)：73-4.

7李娜.氧化苦參堿對大鼠局灶性腦缺血損傷的保護作用〔D〕.長春：吉林大學，2006.

8高迪飛.淺談抗腦缺血藥物的研究進展〔J〕.中國保健營養，2012；22(12)：5484-5.

9劉嬋，涂豐霞，陳翔.芹菜素對大鼠急性腦損傷的保護作用〔J〕.中草藥，2009；40(10)：1598-602.

10汪亮.葛根素對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后TLR4/NF-κB信號通路的影響〔D〕.寧波：寧波大學，2012.

11侯紹章.甘草酸二銨對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及機制研究〔D〕.南京：南京中醫藥大學，2012.

12祝慧鳳，萬東，羅勇，等.梓醇上調 GAP-43 表達伴隨局灶腦缺血大鼠神經功能恢復〔J〕.中國藥理學通報，2007；23(9)：1231-6.

13齊聰儒，孔祥玉.中藥對腦缺血再灌注損傷保護作用的研究進展〔J〕.承德醫學院學報，2008；25(3)：316-8.

14Al Rouq F，El Eter E.PPAR-γ activator induces neuroprotection in hypercholesterolemic rats subjected to global cerebral ischemia/reperfusion injury：In vivo and in vitro inhibition of oxidative stress〔J〕.Exp Gerontol，2013；51(1)：1-7.

〔2015-12-15修回〕

(編輯李相軍)

吉林省教育廳資助課題〔吉教科合字(2014)第98號〕

李娜(1978-)，女，副教授，博士，主要從事中藥藥理研究。

李輝(1978-)，男，醫師，主要從事中藥藥理研究。

R282174

A

1005-9202(2016)16-3895-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.011

1吉林大學基礎醫學院病理生理學系

2長春中醫藥大學