豐富康復訓練對腦出血大鼠Slit2表達的影響

王風波　唐明薇　王瓊芬　李　飛　張　弘

(成都醫學院第一附屬醫院康復醫學科，四川　成都　610500)

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豐富康復訓練對腦出血大鼠Slit2表達的影響

王風波唐明薇王瓊芬李飛張弘

(成都醫學院第一附屬醫院康復醫學科，四川成都610500)

目的觀察大鼠腦出血后同側海馬區Slit2的表達情況及豐富康復訓練的干預效果。方法將66只成年SD大鼠隨機分為對照組、模型組，采用Ⅶ型膠原酶制備誘導尾狀核出血模型，模型組又隨機分為非干預組和豐富康復訓練組，豐富康復訓練組大鼠于造模成功次日開始進行干預，各組大鼠分別于24 h、7 d、14 d及21 d時相點行出血側海馬區免疫組化Slit2檢測。結果與對照組相比，非干預組、豐富康復訓練組大鼠Slit2陽性反應明顯增強(P<0.01)，豐富康復訓練組Slit2表達水平明顯高于非干預組(P<0.01)，各組Slit2陽性反應均以第7天最為顯著。結論豐富康復訓練能顯著增強腦出血大鼠Slit2的陽性表達，促進中樞神經系統的修復與再生。

豐富康復訓練；腦出血；Slit2

腦卒中后中樞神經系統的重塑、修復與再生一直是神經康復學研究的熱點，其影響因素十分復雜，既有神經生長因子、軸突導向因子等促進因素，又有軸突生長抑制因素，如何有效降低抑制因子作用，提高神經生長促進因素效應，對腦損傷后的修復具有重要意義。作為近年來發現的在神經生長和神經元遷移方面都具有重要作用的軸突導向因子Slit2，目前基礎研究主要集中于脊髓損傷和非出血性腦損傷，國內外尚未見到有關腦出血后Slit2表達變化的研究報告，而豐富康復訓練對其影響更是未知。本研究觀察大鼠腦出血后同側海馬區Slit2的表達情況，探討豐富康復訓練在腦出血康復治療中的作用。

1　材料與方法

1.1材料66只SD成年雄性大鼠，體重均≥220 g，由成都大學動物實驗中心提供；Ⅶ型膠原酶(Sigma公司)；大鼠腦立體定位注射儀(江灣Ⅰ型)；微量注射器(上海高鴿)；動物顱骨鉆(ALC-CED)；兔抗大鼠Slit2抗體及(SABC)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2方法大鼠隨機分為對照組(n=24)、模型組(n=42)，模型組又分為非干預組(n=24)和豐富康復訓練組(n=18)，均常規飼養。參照Rosenberg等〔1〕及楊潔等〔2〕方法制備Ⅶ型膠原酶誘導尾狀核腦出血大鼠模型：水合氯醛腹腔麻醉大鼠后固定于腦立體定位儀上，充分暴露前囟，取前囟后0.5 mm，矢狀線右旁側3 mm，動物顱骨鉆鉆孔。Ⅶ型膠原酶0.6 U溶于1.5 μl生理鹽水，微量注射器進針至硬膜下約5 mm并緩慢給藥，注射時間不超過5 min，注射完畢留針8 min，緩慢退針后縫合頭皮。造模全程要求無菌操作。對照組手術操作方法同模型組，注射同等劑量生理鹽水代替膠原酶。術后24 h隨機處死對照組和非干預組大鼠各6只，行肉眼及顯微鏡下觀察腦出血區情況，并用免疫組織化學法檢測Slit2表達。豐富康復訓練組大鼠于造模次日開始進行干預。各組大鼠分別于第7、14及21天時相點行腦出血側海馬區腦組織免疫組化Slit2檢測。

1.3豐富康復訓練

1.3.1早期觸摸造模成功后次日開始將豐富康復訓練組大鼠托至掌心，用軟毛刷從頭至尾刷動，勻速有力，持續15 min/次，1次/d，至第7天。

1.3.2豐富環境刺激第7天開始將豐富康復訓練組大鼠暴露于豐富環境中，包括：轉盤、秋千、搖鈴、管道、爬梯、階梯等，同時給予聲音和彩色燈光刺激，每周更新兩次環境刺激。2 h/d，1次/d，至第14天。

1.3.3康復訓練從第7天開始對豐富康復訓練組大鼠進行康復訓練，1次/d，至第21天。包括:①跑籠訓練:采用圓形轉籠，底座有固定架，大鼠在其內奔跑，10 min/次；②平衡木訓練:平置距地面50 cm處，讓大鼠在上面行走，10 min/次；③網屏訓練：網屏距地面高度為80 cm，下方鋪以海綿，訓練期間觀察大鼠是否會用前爪抓住網屏或從網屏上掉下，10 min/d。

1.4出血側海馬區Slit2免疫組織化學檢測免疫組織化學染色用SABC法，陰性對照用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。光鏡下觀察神經元胞核周圍胞質有棕黃色顆粒為陽性表達。每例腦組織取4張切片，所有切片均在400倍顯微鏡下隨機拍取4個互不疊加的視野，計數陽性細胞，取其平均值。

1.5統計學方法采用SPSS17.0軟件進行t檢驗、q檢驗及秩和檢驗。

2　結　果

2.1肉眼及鏡下觀察大鼠腦組織病理改變造模成功后24 h隨機處死對照組和模型組大鼠各6只，以冠狀面切開進針點腦組織，模型組大鼠右側尾狀核部位可見血腫形成，直徑約2.5 mm，血腫周邊有不規則的水腫帶，光學顯微鏡下可見腦內注射區大量紅細胞滲出聚集，腦神經元大量壞死，其間少許散在存活神經元，血腫周邊有小膠質細胞與中性粒細胞浸潤，出血區內有大量呈黃褐色的含鐵血黃素顆粒。對照組大鼠腦內無血腫形成。

2.2各組大鼠腦出血側海馬區Slit2免疫組化檢測情況對照組右側海馬區可見少量Slit2陽性細胞散在分布。腦出血后，Slit2陽性表達水平明顯升高，與對照組相比，非干預組、豐富康復訓練組出血側海馬區Slit2陽性細胞計數顯著上升(P<0.01)；與非干預組比較，豐富康復訓練組大鼠Slit2陽性反應進一步增強(P<0.01)。非干預組與豐富康復訓練組不同時間點比較均有顯著差異(P<0.01)。各組Slit2陽性反應均以第7天最為顯著。見表1和圖1。

表1　各組大鼠海馬區Slit2陽性細胞計數比較

與對照組比較：1)P<0.01；與非干預組比較：2)P<0.01

圖1　各組第7天Slit2免疫組在檢測大鼠腦出血測海馬區(DAB，×400)

3　討　論

Slit家族是近年來發現的在神經生長和神經元遷移方面都具有重要的導向作用的分泌型蛋白質分子，與表達在軸突表面的受體相互作用，對軸突生長起著排斥性導向作用，引導生長錐朝正確的方向延伸，并決定這些軸突是否穿過中線，或阻止已經穿過中線的軸突迂回〔3〕。Slit的導向作用主要依賴于其濃度梯度而非絕對量。Slits因子分布于成年腦的皮質、海馬、小腦等區域，提示Slits可能在成年腦內發揮某些功能，而成年腦內鮮有軸突誘導現象發生。出生后發育期腦內的Slits和Robo因子表達水平上調并維持在較高的水平，說明Slits的功能不但體現在調控軸突生長和神經元遷移方面，而且極有可能參與了突觸的塑形〔4〕。已觀察到的海馬組織不斷改變連接現象，就可能與Slits參與的神經活性的改進有關。有學者〔5〕用原位雜交研究冷凝損傷的腦組織內Slit-mRNA表達情況，發現所有的Slit-mRNA在壞死區均有不同程度的表達，其中Slit2 mRNA在病灶區周圍腦組織的膠質細胞表達最為明顯，認為Slit2可能產生阻止再生軸突進入病灶的作用，從而成為影響中樞神經再生的原因之一。盡管成年腦內Slit2的表達明顯減少，但在中樞神經系統損傷情況下，多種軸突導向因子及相應受體的表達可再次發生改變，并從多個方面抑制軸突再生〔6〕。有研究用液氯針刺傷成年大鼠腦組織，發現損傷后第7天損傷灶周圍腦組織多種Slit陽性表達，并以Slit2表達水平最高〔7〕。目前認為Slits的功能主要表現在：①對軸突生長的排斥性導向作用；②引導神經細胞的運動；③促進背根神經節軸突的延伸和分支；④抑制化學趨向因子所誘導的白細胞運動。有關中樞神經系統損傷后Slit2表達變化的基礎研究在脊髓損傷方面相對較早開展。劉興波等〔8〕觀察外傷性脊髓損傷大鼠損傷后1～28 d脊髓前角Slit2表達變化情況，發現1 d內陽性表達即明顯升高，3 d達到高峰，5 d開始逐漸呈下降趨勢，至28 d接近正常組水平，但仍略高。劉肅等〔9〕制備切割性胸髓損傷大鼠模型，分別通過逆轉錄聚合酶鏈反應法和免疫組化法檢測Slit2基因表達，觀察大鼠損傷后脊髓的Slit2表達情況，逆轉錄聚合酶鏈反應法結果顯示損傷后12 h即可檢測到Slit2 mRNA的表達，逐漸升高于第3天達高峰，之后表達水平逐漸回降。免疫組化檢測到Slit2蛋白定位于星型膠質細胞和少突膠質細胞的胞質，在正常大鼠脊髓內表達水平較低，于損傷后第3天出現陽性表達并逐漸增多，第7天達到高峰并趨于穩定，第14天開始逐漸下降。尹明錫等〔10〕用改良Allen打擊法制備脊髓損傷大鼠模型，分別用電針及藥物早期干預治療，電針組大鼠于麻醉蘇醒后即造模后大約半小時開始刺激“大椎、命門”等督脈穴位，20 min/d，1次/d；藥物組大鼠于造模后以30 mg/kg體重劑量的甲潑尼龍經尾靜脈注入體內，次日同一時間以5.4 mg/kg劑量的甲潑尼龍經尾靜脈重復注射一次，之后不再給藥；結果顯示，電針組和藥物組大鼠脊髓組織中Slit2 mRNA的表達水平均顯著升高，與模型組比較均有顯著差異，電針組大鼠Slit2 mRNA表達略高于藥物組，但兩組間無統計學意義。近兩年在腦損傷后Slit2表達的基礎研究方面也有了一些成果。呂凱等〔11〕觀察局灶性腦梗死大鼠大腦皮質區Slit2/Robo1的表達，結果顯示腦梗死組Slit2表達水平在術后第1天即開始明顯升高，3 d時上升達高峰，14 d回落到接近基礎水平；該實驗用電針刺激腦梗死大鼠“內關、足三里”等穴，30 min/次，1次/d，電針組Slit2表達水平明顯高于模型非干預組，兩組在不同時間點表達趨勢大體一致，但對照組在14 d時仍高于模型組，提示電針干預可以在一定程度上維持Slit2表達的峰值，延緩下降的趨勢；Robo1的表達情況與趨勢與Slit2基本一致。崔靜等〔12〕用免疫組化法檢測宮內感染致腦損傷仔鼠模型組和康復訓練組腦皮質及海馬區Slit積分光密度，兩組Slit表達水平明顯高于正常對照組，在14 d時達高峰，之后逐漸呈回落，28 d時已低于第7天，兩組間相互比較，康復訓練組仔鼠Slit表達水平高于非干預組。田貴華等〔13〕用改良Feeney打擊法制備顱腦損傷模型，并針刺腦損傷大鼠“人中、百會”兩穴，用免疫組化法觀察腦損傷后48 h、6 d損傷局部腦組織Slit2的表達變化，模型組、針刺組大鼠兩個時間點Slit2的表達均明顯升高，兩組比較，針刺組大鼠Slit2表達顯著高于模型組。從上述研究成果可以看到，各種中樞神經系統損傷后Slit2表達均有不同程度的升高，而早期干預有助于進一步增強表達水平。近年來，豐富康復訓練在腦損傷的康復治療作用與機制有了較多的研究成果，是豐富環境、運動訓練、康復治療時機等積極因素的有機結合，對腦損傷恢復有著確切的作用，筆者也曾做過一些相關研究，并得到了肯定的觀察結果〔14，15〕。本研究說明豐富康復訓練對腦出血后腦組織Slit2的表達有確切的增強作用。本實驗雖僅從出血側海馬區Slit2表達的角度探討豐富康復訓練對腦出血的治療意義，但考慮到Slit2對中樞神經系統損傷后神經生長和神經元遷移方面具有的重要導向作用，證實了豐富康復訓練在腦出血損傷后中樞神經重構方面的作用及價值，進一步為腦出血的臨床早期系統康復治療的重要性和必要性提供了有力的實驗依據并具有一定的指導意義。

1Rosenberg GA，Mun-Bryce BS，Wesley M，etal.Collagenase—induced intracerebral hemorrhage in rats〔J〕.Stroke，1990；21(5)：801-7.

2楊潔，倪厚杰，唐洲平.Ⅶ型膠原酶構建大鼠腦出血模型的組織病理學研究〔J〕.神經損傷與功能重建，2012;7(7)：235-7.

3Stein E，Tessier-Lavigine M.Hierarchial organization of guidance receptor：silencing of netrin attraction by slit through a robo/dcc receptor complex〔J〕.Science，2001;291(5510)：1928-38.

4Marillat V，Cases O，Tuyen K，etal.Spatiotemporal expression patterns of slit and robo genes in the rat brain jour of comparative〔J〕.Neurology，2002;442：130-5.

5Seita H，Ken I，Tetsiji M，etal.Slit and glypican-1 mRNAs are coexpressed in the reactive astrocytes of the injured adult brain〔J〕.Glia,2003;42(2)：130-8.

6Niclou SP，Ehlert EM,Verhaagen J.Chemorepelent axon guidance molecules in spinal cord injury〔J〕.J Neurotrauma，2006;23(3-4)：409-21.

7王楓，都愛蓮.Slit：一種新的神經生長導向因子〔J〕.國外醫學·神經病學神經外科學分冊，2002;29(5)：454-5.

8劉興波，雷曉婷，劉源，等.大鼠脊髓損傷后神經生長因子BDNF/軸突導向因子Slit的表達變化〔J〕.南京醫科大學學報(自然科學版)，2008;28(7)：868-71.

9劉肅，劉華，李化光，等.導向因子Slit2在大鼠脊髓損傷后的表達及其意義〔J〕.中國矯形外科雜志，2007;15(4):293-5.

10尹明錫，宋金鈴，時素華，等.電針對大鼠脊髓損傷后Slit2表達的影響〔J〕.陜西中醫，2010;31(5)：611-3.

11呂凱，李鳳，龔標，等.電針對局灶性腦梗死大鼠皮質Slit2/Robo1表達的影響〔J〕.針刺研究，2013;38(4)：265-70.

12崔靜，李嘵捷，鄧慶先，等.康復訓練對腦損傷仔鼠腦組織中slit 表達的影響〔J〕.中國傷殘醫學，2011;19(5)：20-3.

13田貴華，譚純，姚海江，等.針刺對大鼠顱腦損傷后軸突導向因子Slit2表達的影響〔J〕.中華中醫藥雜志，2011;26(5)：1197-200.

14王風波，唐明薇，李曉捷.電針聯合豐富康復訓練對腦損傷仔鼠腦皮質腦源性神經營養因子表達的影響〔J〕.中國康復理論與實踐，2012;18(8)：717-20.

15王風波，李曉捷，唐明薇.豐富康復訓練對先天性腦損傷仔鼠腦神經髓鞘發育和修復的影響〔J〕.中國傷殘醫學雜志，2011;19(9)：6-9.

〔2015-02-04修回〕

(編輯馮超/曹夢園)

四川省衛生廳科研課題(No.120476)

張弘(1977-)，男，副主任醫師，講師，碩士，主要從事傳統康復治療腦損傷研究。

王風波(1979-)，男，主治醫師，碩士，主要從事中西醫結合治療腦損傷研究。

R493

A

1005-9202(2016)16-3887-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.008