轉凝蛋白基因與胃癌及癌前病變的相關性

潘　科　張人弘　鄭　娟　黃　勻　張丹丹　蒙　韜　吳小艷　趙　艷

(黔南州人民醫院消化內科，貴州　都勻　558000)

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·基礎研究·

轉凝蛋白基因與胃癌及癌前病變的相關性

潘科張人弘鄭娟黃勻張丹丹蒙韜吳小艷1趙艷1

(黔南州人民醫院消化內科，貴州都勻558000)

目的探討轉凝蛋白(transgelin)基因與胃癌前病變及胃癌的關系。方法收集7例慢性非萎縮性胃炎、12例腸上皮化生、4例非典型增生及39例胃癌患者的胃組織，提取及純化總RNA。采用實時熒光定量PCR測定transgelin mRNA的表達水平，分析其與臨床病理參數的關系。結果transgelin mRNA在腸上皮化生、非典型增生及胃癌組織中的表達增加，分別是慢性非萎縮性胃炎組織的4.06倍、73.11倍、13.21倍(均P<0.05)；Ⅳ期胃癌組織transgelin mRNA表達增加，是Ⅰ～Ⅱ期的2.54倍；淋巴結轉移患者胃癌組織transgelin mRNA是無淋巴結轉移組的3.35倍(均P<0.05)。結論transgelin基因可能與胃癌前病變的發生、發展有關，可能是胃癌發生過程中的促進因素。

胃癌前病變；轉凝蛋白

轉凝蛋白(transgelin)與卵巢癌〔1〕、肺癌〔2〕、直腸癌〔3〕等多種腫瘤相關，推斷其可能是腫瘤發生、發展及轉移的一個重要因素。有研究〔4〕發現幽門螺桿菌(H.pylori)感染致胃癌的動物模型中，胃組織中transgelin蛋白表達上調；且在體外實驗研究中發現〔5〕，H.pylori感染可上調transgelin mRNA的表達。但從正常胃黏膜經慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、非典型增生，最后發展成胃癌的過程中，transgelin的水平變化并不清楚。本研究擬探討transgelin mRNA的表達與胃癌前病變及胃癌發生、發展的關系。

1　材料與方法

1.1對象及標本采集收集2013年1月至2015年10月黔南州人民醫院及同期貴州醫科大學附屬醫院收治的經病理學確診的82例胃癌組織標本，其中27例慢性非萎縮性胃炎(男18例、女9例，年齡32～89歲)、12例腸上皮化生(男7例、女5例，年齡30～83歲)、4例非典型增生(男3例、女1例)及39例胃癌(男24例、女15例，年齡30～82歲；胃竇癌28例、胃體癌11例；Ⅰ期2例，Ⅱ期3例，Ⅲ期14例，Ⅳ期20例；淋巴轉移20例，無淋巴轉移19例)。標本收集后-80℃保存備用。

1.2主要儀器及試劑DU640核酸定量儀(美國Beckman公司)，9700型PCR擴增儀、ABI Step one plus型實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。瓊脂糖(美國 Introvergen公司)，Trizol(美國Ameresco 公司)，MMLV逆轉錄酶(美國Promega 公司)，RNA 酶抑制劑、Oligo dT18、dNTPs(中國天根公司)、Power SYBR?Green PCR Master Mix(美國ABI公司)。其他試劑：焦碳酸二乙酯(DEPC)：水、乙醇、氯仿、異丙醇、氯仿-異戊醇(24∶1)均為國產分析純。

1.3總RNA的提取及cDNA合成采用酚-氯仿一步法提取總RNA：取0.1 g組織剪碎后置于勻漿器中，加入1 ml Trizol，在冰浴中迅速勻漿30 s，充分研碎組織，置于室溫5 min后加入0.2 ml氯仿，于渦旋振蕩器搖振15 s，置于室溫下3 min，以12 000 r/min 4℃離心15 min，吸取上清，加入0.5 ml異丙醇混勻，室溫靜置2 h，12 000 r/min 4℃離心15 min，棄上清，加入75%乙醇清洗，棄上清，加入無核酸水50 μl，用核酸定量儀(DU640)檢測RNA濃度。

逆轉錄合成cDNA：參照說明書操作，在25 μl反應體系中分別加入樣本RNA 3 μl、Oligo(10 pmol/L)1 μl混勻后放置于PCR儀中65℃(10 min)、4℃(10 min)后轉至冰上，再加入dNTPs(10 mmol/L)2 μl、5×buffer 4 μl、RNAse Inhibitor(40 U/μl) 0.5 μl、MMLV (200 U/μl)0.5 μl，最后加DEPC處理水至25 μl，55℃孵育30 min、85℃孵育5 min、4℃孵育10 min合成cDNA，置-20℃保存。

1.4SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測transgelin基因的表達選用次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶1(HPRT1)作為內參基因，登陸GenBank獲取差異蛋白基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計引物，由上海生工生物技術服務公司合成引物序列。實時熒光定量PCR引物序列：HPRT1上游：5'-TGAGGATTTGGAAAGGGTGT-3'，下游：5'-GAGCACACAGAGGGCTACAA-3'，產物長度118 bp，GenBank登錄號：NM-000194.2；transgelin上游：5'-TGGAGATCCCAACTGGTTTATG-3'，下游：5'-CTGCCGAGGTCGTCCGTAG-3'，產物長度157 bp，GenBank登陸號：M-003186。PCR反應體系20 μl：Hotsybr Real-time PCR Master Mix(2×)10 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μl，cDNA模板(300 ng)2 μl，加DEPC補足至20 μl。PCR循環參數：95℃預變性10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環。

transgelin基因和HPRT1的擴增循環熒光信號Ct值由ABI Step one plus型實時熒光定量PCR儀采集，計算transgelin基因的相對表達量(2-ΔΔCt)，其中△△Ct=實驗組(Cttransgelin-CtHPRT1)-對照組(Cttransgelin-CtHPRT1)。

1.5統計學方法應用SPSS20.0軟件，并對各組數據進行正態性和方差齊性檢驗，組間比較采用方差分析和q檢驗。

2　結　果

2.1RNA純度的鑒定胃組織RNA的A260/A280值為1.8～2.0，濃度為400～800 μg/ml，1.5%瓊脂糖凝膠電泳中，細胞RNA和組織RNA中的28S rRNA、18S rRNA清晰可見，表明提取的RNA質量較好。見圖1。

1和4，慢性非萎縮性胃炎組；2和6，胃癌組；3，腸上皮化生組；5，非典型增生組圖1　RNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜

2.2transgelin mRNA在各組胃組織中的表達水平transgelin基因在腸上皮化生、非典型增生及胃癌組織中的表達增加(均P<0.05)，見表1。

表1　各組胃組織中transgelin mRNA的表達

與慢性胃炎組比較：1)P<0.05；與腸上皮化生組比較：2)P<0.05

2.3transgelin mRNA的表達與腫瘤病理特征的關系與胃癌組織Ⅰ～Ⅱ期transgelin mRNA表達水平相比，胃癌組織Ⅳ期表達明顯增加；淋巴結轉移患者胃癌組織transgelin mRNA表達增高(均P<0.05)，見表2。

表2　transgelin mRNA表達與胃癌患者臨床病理參數的關系

與其他亞組比較：1)P<0.05

3　討　論

transgelin 蛋白是一種重要的細胞骨架相關蛋白，不僅參與細胞骨架重構，而且還可作為信號分子參與細胞生長；也在平滑肌分化為干細胞和胚胎血管發育及細胞外基質降解和血管生成中起到重要的作用〔6〕。文獻研究發現，細胞骨架結構和功能的改變與腫瘤形成和發展密切先關，是一個必不可少的重要因素，transgelin在多種腫瘤組織中表達異常，可能與腫瘤的發生、發展及轉移密切相關〔7〕。

本實驗發現，transgelin基因在腸上皮化生、非典型增生及胃癌組織中的表達高于慢性炎癥組織，因此推測transgelin可能與胃癌的發生有關。這與Yu等〔8〕、趙艷等〔4〕研究結論一致，可能在于transgelin通過重構細胞骨架、形成偽足小體或參與上皮細胞的遷移等，對細胞的侵襲、遷移及分化起到促進作用，在胃癌的發生、發展及轉移中起著重要的作用。本研究中，transgelin基因在胃癌Ⅳ期組織及已經發生淋巴轉移的胃癌組織表達明顯升高，也支持了上述觀點。且Yu等〔8〕研究也發現trangelin蛋白可改變腫瘤微環境，促進胃癌細胞遷移和入侵。有研究發也現，transgelin在缺氧的肺癌細胞中高表達，使用小型干擾RNA，可減少遷移能力〔9〕；且在胰腺癌患者中已發生淋巴轉移者transgelin 表達明顯上調，因此推斷transgelin與淋巴轉移密切相關，且transgelin可能是晚期胰腺癌新的預后標志物〔10〕。Lee等〔11〕研究發現，transgelin在腫瘤細胞中表達量顯著高于非腫瘤細胞，是非腫瘤細胞的25倍，并可對腫瘤干細胞的遷移和入侵起促進作用。另外，翁永強等〔12〕研究發現，高轉移肝癌細胞的樹突細胞組transgelin的表達顯著高于正常的樹突細胞組。以上研究都說明transgelin基因在某些腫瘤發生、發展和轉移過程中有重要作用，但有研究發現，在人乳腺癌、結腸癌〔13〕及卵巢漿液性癌〔1〕等研究中均發現，transgelin水平均下降，甚至在卵巢交界性漿液性瘤、卵巢漿液性癌的早期發生過程中，transgelin基因表達減弱或無表達，且Goctinck等〔14〕研究認為transgelin可能抑制腫瘤細胞的遷移和浸潤。因此，對于不同腫瘤transgelin 表達差異的具體機制也需進一步研究。

1劉志輝.Transgelin基因與蛋白在卵巢漿液性腫瘤中的表達及臨床意義〔D〕.沈陽：中國醫科大學，2005.

2劉艷茹.Transgelin基因在肺腺癌發展中的作用研究〔D〕.杭州：浙江大學，2014.

3李里，彭佳遠，馬延磊，等.Transgelin蛋白在人結直腸癌中的表達及其臨床意義〔J〕.腫瘤，2009；29(8)：765-7.

4趙艷，謝淵，陳嫻，等.幽門螺桿菌感染蒙古沙鼠胃癌模型的建立及蛋白質組學研究〔J〕.中華病理學雜志，2014；43(11)：1-7.

5趙艷，謝淵，王文玲，等.transgelin基因在幽門螺桿菌感染胃癌細胞及人胃癌組織中的表達〔J〕.臨床檢驗雜志，2014；32(12)：920-2.

6白霞，張連峰，周琳，等.靶向干擾骨架蛋白Transgelin抑制胰腺癌裸鼠移植瘤的生長〔J〕.中華普通外科雜志，2013；28(7)：538-41.

7劉志輝，王敏，史春雪，等.Transgelin基因在卵巢漿液性腫瘤中的表達〔J〕.中國現代醫學雜志，2010；20(19)：2933-6.

8 Yu B，Chen X，Li J，etal.Stromal fibroblasts in the microenvironment of gastric carcinomas promote tumor metastasis via upregulating TAGLN expression〔J〕.BMC Cell Biol,2013；14：17.

9 Wu X，Dong L，Zhang R，etal.Transgelin overexpression in lung adenocarcinoma is associated with tumor progression〔J〕.Int J Mol Med，2014；34(2)：585-91.

10 Zhou L，Zhang R，Zhang L，etal.Upregulation of transgelin is an independent factor predictive of poor prognosis in patients with advanced pancreatic cancer〔J〕.Cancer Sci，2013；104(4)：423-30.

11 Lee EK，Han GY，Park HW，etal.Transgelin promotes migration and invasion of cancer stem cells〔J〕.J Proteome Res，2010；9(10)：5108-17.

12翁永強，袁祖榮，張益軍，等.負載肝癌細胞裂解物的樹突狀細胞Transgelin表達水平與其功能的關系〔J〕.中華肝臟病雜志，2008；16(7)：514-8.

13 Shields JM，Rogers-Graham K,Der CJ.Loss of transgelin in breast and colon tumors and in RIE-1 cells by Ras deregulation of gene expression through Raf-independent pathways〔J〕.Biol Chem，2002；277(12)：9790-9.

14 Goctinck S，Watcrston RH.The caenorhabditis elegans muscle-affecting gene uric-87 encodesa novel thin filament-associated protein〔J〕.J Cell Biol，1994；127(1)：79-93.

〔2016-02-11修回〕

(編輯袁左鳴)

國家自然科學基金(81260303)；貴州省科技攻關計劃項目(黔科合SY字〔2011〕3067號)；黔南州社會發展科技計劃(黔南科合社字〔2012〕13號)；貴州省科技合作計劃項目(黔科合LH字〔2015〕7360)

趙艷(1973-)，女，副教授，碩士，主要從事腫瘤分子生物學研究。

潘科(1974-)，男，副主任醫師，碩士，主要從事消化道腫瘤的發病機制研究。

R735

A

1005-9202(2016)16-3869-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.001

1貴州醫科大學分子生物學重點實驗室