華肖菝葜組織培養(yǎng)技術(shù)的初步研究

弓強(qiáng)　王貴軍

摘 要：為了更好地開發(fā)利用華肖菝葜，該研究以華肖菝葜幼嫩帶芽莖段為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，研究了不同植物激素組合對(duì)華肖菝葜組織培養(yǎng)的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明：外植體的最佳消毒方式為20%次氯酸鈉消毒20min，最佳啟動(dòng)培養(yǎng)基為MS+6-BA6.0mg/L+NAA0.15mg/L+活性炭1 000mg/L，在啟動(dòng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)25d左右誘導(dǎo)率達(dá)到76%。

關(guān)鍵詞：華肖菝葜；組織培養(yǎng)；植物激素；外植體

中圖分類號(hào) R282.71 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2016）16-0027-03

Abstract：The aim of the research was to develop and utilize Heterosmilax chinensis Wang better. Taking the young stem of Heterosmilax chinensis Wang as the explant，using the MS as the basic culture medium，the effects of hormone combination on callus formation and plantlet regeneration of Heterosmilax chinensis Wang were studied in this paper. The results indicated that：The optimum disinfection method of explatrts was disinfecting with 20% sodium hypochlorite for 20 min.The optimum initial medium was MS+6-BA 6.0mg/L+NAA 0.15mg/L+activated carbon 1 000mg/L，with the induction rate being reach 76%，when cultivated in initial medium for 25d.

Key words：Heterosmilax chinensis Wang；Tissue culture；Plant hormone；Explant

華肖菝葜為百合科華肖菝葜（Heterosmilax chinensis Wang）或短柱肖菝葜（Heterosmilax yunnanensis Gagneb）的攀援灌木，主要產(chǎn)地為四川中部至東南部、云南東南部、廣西西南部和廣東北部。生于海拔300～2 100m的山谷密林中或灌叢下[1]。白土苓為華肖菝葜或短柱肖菝葜的干燥塊莖，收載于《中華本草》，其味甘、淡，性平，具有清熱利濕、解毒消腫等作用，用于小便淋濕、白濁、帶下、癰腫消毒等癥[2]。白土苓用藥歷史長(zhǎng)，與中國(guó)藥典收載的土茯苓不僅藥名相近，而且歷代本草常以同藥名土茯苓記載。《本草綱目》[3]一謂“土茯苓有赤白2種，入藥用白者良”，所稱白者為白土茯苓，赤者為土茯苓。在我國(guó)很多地區(qū)常把白土茯苓作土茯苓使用，混用歷史較悠長(zhǎng)，市場(chǎng)上藥材品種混亂，真?zhèn)坞y辨別[4]。最新研究表明，華肖菝葜提取物中含有β-谷甾醇、棕櫚酸和硬脂酸[5-6]，在利尿、抗炎、抑菌、解毒、腫瘤抑制等方面具有顯著作用[7]。

華肖菝葜入藥部位根的生長(zhǎng)年限較長(zhǎng)，資源更新較慢。近年來，這一野生資源由于人們的過度挖掘，日益減少，加之其花序小，單性異株，種子難于采收[8-9]。華肖菝葜的繁殖主要依靠自然分蘗或?qū)嵣敝常痔Y能力及種子發(fā)芽率低，扦插或嫁接較難成活[10]。為了更好地開發(fā)利用保護(hù)這一野生資源，筆者對(duì)華肖菝葜的組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了初步研究。采用組織培養(yǎng)，可以快速獲得大量無菌苗，對(duì)保護(hù)這一野生資源具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗(yàn)用的華肖菝葜外植體取自上午09：00—11：00當(dāng)年萌生的健壯帶芽莖段。試劑：蔗糖、瓊脂、酒精、次氯酸鈉、6-BA、NAA、HCl、活性炭，以上試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要添加其他物質(zhì)（6-BA、NAA、活性炭等），定容至1 000mL，用1mol/LNaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至5.8。最后培養(yǎng)基中加9g的瓊脂和30g蔗糖，在121℃高壓滅菌20min，備用。在配制母液時(shí)，把Ca2+與SO42-、Ca2+與PO43-放在不同的母液中，以免發(fā)生沉淀。各種母液配完后，分別用玻璃瓶貯存，并且貼上標(biāo)簽，注明母液號(hào)、配制倍數(shù)、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。在使用提前配制的母液時(shí)，應(yīng)在量取各種母液之前，輕輕搖動(dòng)盛放母液的瓶子，如果發(fā)現(xiàn)瓶中有沉淀、懸浮物或被微生物污染，應(yīng)立即淘汰這種母液，重新進(jìn)行配制。

1.2.2 外植體消毒 取當(dāng)年萌生的華肖菝葜帶芽莖段，剪去殘傷及葉片，先用軟毛刷蘸洗衣粉水輕刷干凈，然后用流水沖洗30min后，再用無菌水沖洗3次。在超凈工作臺(tái)上用70%的酒精浸泡15s，用20%的次氯酸鈉溶液消毒，采用5個(gè)不同的時(shí)間分別處理5、10、15、20、25min。消毒好的外植體用無菌水沖洗5次，用消毒濾紙吸干水分，備用。在持續(xù)滅菌時(shí)間內(nèi)定時(shí)用玻璃棒輕輕攪動(dòng)，以促進(jìn)植物材料各部分與消毒液充分接觸，驅(qū)除氣泡，使滅菌徹底。

1.2.3 啟動(dòng)培養(yǎng) 消毒好的外植體用無菌水沖洗5次，用消毒濾紙吸干水分，接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（A0-A12）上。培養(yǎng)基A0～A12植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為6-BA、NAA，如表1所示。30d后統(tǒng)計(jì)萌芽數(shù)量，計(jì)算誘導(dǎo)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體最佳消毒時(shí)間的確定 滅菌劑的要求是滅菌效果好，從植物組織上清除容易，對(duì)人體無害，無環(huán)境污染。70%～75%的酒精是最常見的表面滅菌劑，具有較強(qiáng)的穿透力和滅菌作用，但對(duì)植物材料的殺傷作用也很大。氯化汞的滅菌效果極佳，但缺點(diǎn)是易在植物材料上殘留，對(duì)環(huán)境危害大，對(duì)人有毒害。次氯酸鈉是一種較好的滅菌劑，滅菌能力強(qiáng)，不易殘留，對(duì)環(huán)境無害。在多次預(yù)試驗(yàn)中用次氯酸鈉對(duì)外植體消毒，其效果較好。因此，實(shí)驗(yàn)采用次氯酸鈉對(duì)華肖菝葜帶芽莖段消毒。由表2可以看出，用20%次氯酸鈉對(duì)華肖菝葜帶芽莖段消毒，在處理25min時(shí)，材料的污染率最低，效果最好，因此確定外植體的最佳消毒時(shí)間為20min。

3 討論

在本次試驗(yàn)中出現(xiàn)了褐化現(xiàn)象，這主要是在初期培養(yǎng)中，基本培養(yǎng)基上中高濃度的鹽可以促進(jìn)外植體內(nèi)酚類物質(zhì)的大量分泌，酚類化合物被氧化形成褐色的醌類物質(zhì)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)6-BA添加量減少時(shí)，褐化率明顯降低，這主要是因?yàn)?-BA能促進(jìn)酚類化合物的合成，并具有刺激多酚氧化酶活性的作用[12-13]，從而促進(jìn)了外植體的褐化程度。在培養(yǎng)基中加入活性炭之后褐化的外植體明顯減少，因?yàn)榛钚蕴勘砻娣e大，可以吸附非極性物質(zhì)及色素大分子，減少一些有害物質(zhì)的影響。華肖菝葜在到目前為止所用過的培養(yǎng)基中，沒有看到一般愈傷組織的形成，這是因?yàn)槠湫纬傻母鞣N微小的愈傷組織隨著根系的進(jìn)一步分化逐漸消失[14]，因此也就沒有像其他植物那樣建立起莖、根等營(yíng)養(yǎng)體接種到培養(yǎng)基上形成愈傷組織后再分化的系統(tǒng)。

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