Ad-TRAIL對人T淋巴瘤細胞的感染效果及體外抗腫瘤作用

張玲玲

(北京大學國際醫院，北京102206)

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·基礎研究·

Ad-TRAIL對人T淋巴瘤細胞的感染效果及體外抗腫瘤作用

張玲玲

(北京大學國際醫院，北京102206)

目的研究攜帶腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)基因的重組腺病毒(Ad-TRAIL,AdT)對人T淋巴瘤Jurkat細胞株的感染效果及體外抗腫瘤作用。方法 人T淋巴瘤Jurkat細胞株應用攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的重組腺病毒載體(Ad-GFP，AdG)處理，以流式細胞儀分析細胞的GFP表達率。以AdT處理Jurkat細胞后，RT-PCR檢測AdT感染后1、3、5、7天TRAIL基因的表達情況；MTT法檢測AdT單藥以及和化療藥物阿霉素(ADM)、依托泊苷(VP-16)、長春新堿(VCR)、地塞米松(DXM)聯合用藥的細胞毒作用；采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。結果腺病毒可成功感染Jurkat細胞，AdT感染Jurkat細胞后目的基因TRAIL可有效表達，并持續至感染后7 d左右。AdT作用細胞后，可抑制Jurkat細胞的增殖。MTT檢測顯示，AdT對腫瘤細胞的增殖抑制呈劑量依賴關系(P均<0.05)。流式細胞儀檢測發現，AdT可誘導淋巴瘤細胞凋亡，且隨著劑量增加，誘導凋亡作用增強(P均<0.05)。MTT和流式細胞儀檢測發現，AdT和DXM聯合對Jurkat細胞的增殖抑制和誘導凋亡起協同作用，AdT和ADM、VP-16、VCR聯合對細胞的增殖抑制為單純相加作用。結論 AdT可成功轉染人T淋巴瘤Jurkat細胞株并誘導細胞凋亡，其和化療藥物聯用對抑制細胞增殖可起到協同或相加作用。

T細胞淋巴瘤；腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體；感染；殺傷力

T細胞性非霍奇金淋巴瘤(T-NHL)在中國、日本等東南亞地區人群中發病率較高，占淋巴瘤發病率的25%～30%[1，2]。T-NHL的侵襲性強，臨床過程兇險，預后較差[3]， 5年總生存率只有25%左右[4]。亟需探尋新的治療手段以改善T-NHL的療效并降低治療的不良作用。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)是近年發現的具有選擇性誘導腫瘤細胞凋亡而對正常細胞沒有毒性的腫瘤壞死因子家族成員。為改善T-NHL的治療效果，2014年12月～2015年2月，我們研究了重組腺病毒載體攜帶人TRAIL基因(AdT)對T-NHL的體外抗腫瘤作用，為體內試驗和進一步的臨床研究提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料人T淋巴瘤Jurkat細胞株，購自中國醫學科學院，培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640(pH 7.4)培養基中，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，取對數生長期細胞進行實驗，每組均設3個復孔。RPMI-1640培養液及胎牛血清購自Gibco公司，攜帶TRAIL基因的重組腺病毒(Ad-TRAIL, AdT)及攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的重組腺病毒(Ad-GFP，AdG)由美國MD.Anderson癌癥中心提供，四甲基偶氮唑藍(MTT)及分析純二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司，PCR試劑購自上海申能博采公司，TRAIL引物及GAPDH引物購自上海英駿生物公司，ReverseTranscription System購自美國Promega公司，TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，Adeno-XTMRapidtiter試劑盒購自BD Biosciences公司。

1.2AdT和AdG的擴增、純化及滴度測定按參考文獻[5]進行，其滴度分別為AdT:7.42×1010PFU(空斑形成單位)/mL;AdG:8.02×1010PFU/mL。

1.3細胞感染效率的檢測取對數生長期細胞制成單細胞懸液，以1×106/mL的密度接種于6孔板，每孔1 mL。以不同滴度的AdG感染細胞，感染復數(MOI)分別為0、200、400。并設空白對照。繼續培養48 h后，收集細胞，以流式細胞儀檢測細胞GFP的表達情況。GFP的表達率反映細胞的感染效率。

1.4TRAIL基因表達的檢測采用RT-PCR法。以MOI=200的AdT或AdG感染細胞，分別于AdT感染后1、3、5、7 d，AdG感染后3 d收集細胞。用TRIzol提取細胞總RNA后，反應分兩步進行，先按照mRNA 逆轉錄試劑盒的說明將總RNA 1 μg逆轉錄為cDNA，再以cDNA為模板根據PCR方法建立反應體系，反應條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃ 1 min、53 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，共26個循環。目的基因TRAIL的上游引物為5′-TTCACAGTGCTCCTGCAGTC-3′，下游引物為5′-TCACCATTCCTCAAGTGCAA-3′，擴增長度為455 bp；內參照物為GAPDH，上游引物為5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′，下游引物為5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′，擴增長度為185 bp。擴增產物取8 μL 用1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5細胞增殖抑制率的檢測采用MTT比色法。分別檢測AdT單藥以及和化療藥物阿霉素(ADM)、依托泊苷(VP-16)、長春新堿(VCR)、地塞米松(DXM)聯合用藥的細胞毒作用。將細胞以1×105/mL的密度接種于96孔板，每孔100 μL。AdT和AdG設立4個劑量滴度，MOI分別為25、50、100、200；AdT和藥物聯合組每孔加入MOI為100的AdT。繼續培養24 h后，轉移至含10%新生牛血清的RPMI-1640培養基100 μL。檢測計算各藥物的IC50值，以IC50為中心選取5個藥物濃度，于AdT和藥物聯合組分別加入不同濃度的化療藥物。繼續培養72 h后，收集細胞進行MTT檢測。每孔加入濃度為5 mg/mL的MTT 溶液20 μL，繼續孵育4 h后每孔加DMSO 150 μL，檢測前水平搖床輕搖10 min，待MTT結晶充分溶解后置自動酶標儀測定各孔在540 nm波長處吸光度的A值。按以下公式計算細胞的增殖抑制率。細胞增殖抑制率(IR, %)=[(1-實驗孔A值-空白孔A值)/(對照孔A值-空白孔A值)]×100%(公式1)；AdT和化療藥物聯合的作用采用金(正均)氏公式計算：q=EA+B(實測合并效應)/EA+EB-EA*EB(預期合并效應)(公式2)。q的意義：0.85～1.15為單純相加(+)；>1.15～2為協同(++)；>20為明顯協同(+++ )；<0.85～0.55為拮抗(-)；<0．55為明顯拮抗(-)。

1.6細胞凋亡率的檢測 采用流式細胞術。將細胞以1×106/mL的密度接種于6孔板，每孔1 mL，分別以AdT、AdG、DXM、AdT+DXM聯合處理各組細胞，并設置細胞對照組。以2%新生牛血清培養基稀釋的AdT和AdG感染細胞，MOI分別為200、400；AdT+DXM聯合組加入MOI為100的AdT，培養24 h后，轉移至含10%新生牛血清的RPMI-1640培養基1 mL，DXM組和AdT+DXM聯合組分別加入DXM 200 μmol/L，繼續培養72 h。收集細胞，加入70%乙醇固定過夜。碘化丙啶進行DNA染色后，以流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2　結果

2.1AdG對Jurkat細胞的感染效率流式細胞儀檢測顯示，48 h后，MOI=200時細胞GFP的表達率為67.2%±3.5%；MOI=400時細胞GFP的表達率為81.5%±4.7% ,而空白對照細胞無GFP表達。

2.2AdT感染Jurkat細胞后TRAIL基因的表達提取的部分細胞總RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見明顯的三條目的條帶，無明顯的降解，OD260/OD280的比例都在 1.8～2.0。AdT感染Jurkat細胞后，TRAIL基因的表達逐漸增高，第 3天達到了高峰，隨后，表達逐漸下降，第 7天只能檢測到TRAIL基因微弱的表達。 AdG感染后的第3天的腫瘤細胞沒有出現TRAIL的目的條帶。見圖1。

注：Lane 1、2、3、4 AdT感染第1、3、5、7天TRAIL mRNA的表達；Lane 5 AdG感染第3天TRAIL mRNA的表達。

圖1Jurkat細胞TRAIL基因的表達

2.3AdT單藥及與化療藥聯用對Jurkat細胞的增殖抑制率的影響見表1。AdT對腫瘤細胞的增殖抑制呈劑量依賴關系，當MOI為200的AdT感染細胞72 h后，抑制率為39.60%±6.19%，而AdG感染細胞后，并沒有明顯抑制Jurkat細胞的增殖。單用濃度為0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2 μmol/L的ADM作用72 h后對Jurkat細胞的抑制率分別為7.7%±3.7%、8.5%±4.6%、9.6%±4.0%、14.8%±3.2%、15.0%±3.0%，聯合MOI為100的AdT后對細胞的抑制率分別為43.0%±4.6%、43.4%±4.3%、45.6%±5.7%、46.6%±3.9%、50.2%±4.2%, 與各單藥組相比，P均<0.05。單用濃度為0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L的VP-16作用72 h后對Jurkat細胞的抑制率分別為12.7%±4.7%、24.9%±4.4%、55.7%±3.1%、71.3%±1.8%、81.5%±0.9%，聯合MOI為100的AdT后對細胞的抑制率分別為40.7%±2.9%、52.2%±3.1%、76.7%±0.6%、82.3%±1.6%、85.6%±1.3%，與各單藥組相比，P均<0.05。單用濃度為0.006 25、0.012 5、0.025、0.05 mol/L、0.1 μmol/L的VCR作用72 h后對Jurkat細胞的抑制率分別為35.1%±4.9%、57.0%±3.7%、62.3%±3.5%、63.2%±3.0%、67.0%±3.9%，聯合MOI為100的AdT后對各組細胞的抑制率分別為60.8%±2.9%、62.6%±2.8%、64.3%±1.2%、66.7%±2.2%、68.1%±1.5%，與各單藥組相比，P均<0.05。單用濃度為12.5、25、50、100、200 μmol/L的DXM作用72 h后對Jurkat細胞的抑制率分別為0.6%±5.8%、2.9%±4.4%、4.0%±3.6%、15.2%±3.7%、17.6%±5.6%，聯合MOI為100的AdT后對Jurkat細胞的抑制率分別為45.4%±2.9%、50.8%±3.6%、51.7%±3.6%、54.8%±4.2%、67.2%±5.7%，與各單藥組相比，P均<0.05。AdT和ADM、VP-16、VCR聯合對細胞的增殖抑制為單純相加作用，其q值在0.85～1.15。

表1　不同MOI的AdT、AdG對Jurkat細胞的增殖抑制率比較

注：與AdG比較，*P<0.05。

2.4AdT單用及聯用DXM誘導Jukat細胞的凋亡情況AdT可誘導淋巴瘤細胞的凋亡，且隨著劑量增加，誘導凋亡作用增強。當MOI=200的AdT感染細胞72 h后，細胞凋亡率為36.5%±3.7%；MOI=400時，細胞凋亡率為51.8%±2.4%。與細胞對照組(3.1%±0.7%)相比，P均<0.05。而MOI為400的AdG感染細胞72 h后，與細胞對照組相比，凋亡率(3.3%±0.5%)未見明顯增加(P>0.05)。流式細胞儀檢測顯示，MOI為100的AdT和DXM聯用可增強DXM誘導的Jurkat細胞凋亡。200 μmol/L的DXM作用Jurkat細胞72 h后細胞的凋亡率為11.9%±0.0%，MOI為100的AdT作用細胞72 h后細胞的凋亡率為26.3%±2.8%，二者聯合后細胞的凋亡率為59.6%±5.4%，與各單藥組相比,P均<0.05。金正均公式計算顯示，AdT和DXM聯合對Jurkat細胞的增殖抑制和誘導凋亡有協同作用，其q值大于1.15。

3　討論

T-NHL是亞洲人群中發病率較高的淋巴瘤亞型，在國內發病率占NHL的25%左右[2，5]。與B細胞淋巴瘤相比，其治療效果欠佳。因此，尋找新的更為有效安全的治療手段具有十分重要的意義。臨床前的研究已經證實，TRAIL能誘導多種腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤生長并延長動物腫瘤模型的生存期，并與多種化療藥物如ADM、順鉑和依利替康以及放療均有很好的協同作用，甚至對化放療抵抗的腫瘤仍然有較好的療效，提示其為一種非常有前途的抗癌藥物。但可溶性TRAIL蛋白的體內半衰期過短[6]；而且TRAIL蛋白對于經常以結外局部侵犯的T-NHL來說，作用于局部病灶的藥物濃度相對較低。利用基因載體介導TRAIL基因在腫瘤細胞內的特異表達以克服TRAIL蛋白治療的局限性成為近年來研究的熱點。基因治療能克服TRAIL的缺點，使TRAIL蛋白在腫瘤內部得到持續而穩定的表達，可以改善治療效果。

本研究采用重組腺病毒載體攜帶人TRAIL基因針對T-NHL進行基因治療,探討AdT應用于T-NHL局部治療的可行性。我們的研究發現腺病毒可以成功轉染T淋巴瘤細胞，MOI=200時感染效率超過60%。已有多個研究證實腺病毒是介導TRAIL基因的合適載體[7～9]。腺病毒是通過細胞表面的兩種受體介導的入胞作用而轉染入細胞內的[10，11]。柯薩奇-腺病毒受體與腺病毒黏附然后通過αVβ3和αVβ5交聯受體介導病毒內化。有研究證明，Jurkat細胞表面高表達這兩類受體[8, 12]，因此腺病毒能成功轉染Jurkat細胞。

我們的實驗觀察到腺病毒感染Jurkat細胞后可持續有效地表達目的基因，TRAIL基因于感染后第1天開始表達，可持續至感染后第7天。這說明TRAIL基因治療能克服TRAIL可溶性蛋白半衰期短的缺點，使TRAIL蛋白在腫瘤內部得到持續而穩定的表達。

TRAIL可與胞膜特異性受體DR4、DR5結合來激活死亡受體通路,繼而通過線粒體通路和非線粒體通路引起腫瘤細胞凋亡[13]。有研究證明TRAIL蛋白可誘導Jurkat細胞株凋亡，且與多種藥物如化療藥物、靶向藥物等有協同作用。其誘導凋亡作用主要是通過外源性途徑，并涉及多種凋亡相關蛋白的表達[14]。本實驗中，我們采用MTT法檢測腺病毒介導的TRAIL基因作用于腫瘤細胞后細胞的增殖率，結果發現AdT可抑制Jurkat細胞的增殖，隨著濃度的增加和作用時間的延長抑制作用增大。其次，流式細胞儀的檢測也發現，AdT感染Jurkat細胞后，可以誘導細胞凋亡。本實驗首次發現T-NHL細胞株Jurkat對TRAIL基因治療也是敏感的，證實了TRAIL是通過誘導T淋巴瘤Jurkat細胞株的凋亡而抑制其增殖的。但其機制是否和可溶性TRAIL蛋白誘導凋亡的機制相同，尚需進一步的研究。

因ADM、VP-16、VCR、DXM為臨床常用的治療T-NHL的化療藥物，因此我們進一步研究了AdT和上述藥物聯用對Jurkat細胞株的殺傷作用，以探討AdT體內局部用藥聯合全身化療的可行性。本研究發現，AdT和任何一種化療藥物聯用對Jurkat細胞的殺傷效果均比化療藥物或AdT單用要強。提示AdT局部用藥和全身化療聯合是可行的，并不會減弱全身化療的抗腫瘤作用，但需要更進一步的試驗和體內研究證實。

本試驗表明AdT可成功轉染T淋巴瘤Jurkat細胞株并誘導細胞凋亡，其和化療藥物聯用對誘導細胞凋亡可起到協同或相加作用。首次探討了腺病毒為載體的TRAIL基因在T-NHL治療中應用的可能。初步顯示了TRAIL基因治療是一種有效的治療策略，為T-NHL的治療提供了一個潛在的治療途徑。今后應進一步研究AdT對化療耐藥的T-NHL細胞株的殺傷效果，并進行AdT的動物實驗以探討AdT體內局部用藥以及與全身化療聯合對T-NHL的抗腫瘤作用。

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R733.4

A

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2015-03-09)