櫻花組培快繁體系的建立及組培苗移栽技術研究

鄭慈真　何文杰　尹　茜　齊躍強

（廣州市名卉景觀科技發展有限公司，廣東　廣州　510420）

櫻花組培快繁體系的建立及組培苗移栽技術研究

鄭慈真何文杰尹茜齊躍強

（廣州市名卉景觀科技發展有限公司，廣東廣州510420）

以4個櫻花品種為研究對象，主要采用腋芽（側芽）誘導方法，建立了腋芽誘導培養系，并建立了試管苗初代培養，優化了繼代培養和生根培養基，并提出了腋芽誘導規模化生產櫻花試管苗的可行性程序和試管苗移栽的可行性程序。

櫻花；脫毒；組培培養；試管苗生根；組培苗移栽

櫻花（Prunusserrulata）是世界著名的觀賞花木，隸屬于薔薇科（Rosaceae）櫻屬（Cerasus），分布于北半球溫暖地區，為北溫帶植物，亞洲、歐洲至北美洲均有記錄。該屬包括百余種成員，主要種類分布在我國西部和西南部以及日本和朝鮮［1］。

櫻花為早春觀賞花木，其株型優美，花色艷麗，花期延續期長，在園林上具有極大的應用價值，可廣泛應用于公園、學校、街道、庭院等綠地中。由于櫻花具有極高的觀賞價值，引種培育工作逐步被人們重視，尤以日本遙遙領先［2］。截至目前，培育品種在花型、花色、株形等各方面觀賞價值都有了極大的提高，品種數量也日益增多。

櫻屬植物在我國栽培歷史悠久，早在2000多年前的秦漢時期，櫻花就已在宮庭中作為祭祀大典中的貢品栽培，但一直以來對于櫻花品種的研究相對較少。國內櫻花栽植雖多，但大都引自日本，不如鄉土樹種適應性好，對于櫻花景觀配置和園林應用價值缺乏系統研究，嚴重制約了櫻花在園林應用中的發展。而我國擁有十分豐富的野生櫻花資源，遠遠超過日本及相鄰國家，分布范圍也非常寬廣，從東北到西南都有分布，其中有許多觀賞價值極高的種類，其世界聲譽卻遠遜于日本，如能對國產櫻花進行進一步的研究開發利用，培育出新品種，必可擺脫依靠進口新品種的局面［3，4］。

1　國內外櫻花的研究概況

1.1國內外櫻花組織培養研究進展

1992年，沈惠娟先生在《木本植物組織培養技術》［5］中對部分食用櫻桃類的組織培養研究作了小結，并列出了部分研究者摸索出的分化和生根培養基配方及外植體再生方式。1998年，及華［6］對山櫻花進行了離體快速繁殖試驗，用不同配方的培養基對不同階段進行了處理，得到了較好的生根組合。

陸貴巧、林青、榮冬青、閆道良等做了一系列提高櫻花嫩枝扦插生根成活率的試驗，在提高扦插生根量方面做了一些探討，在此基礎上閆道良提出了開發利用國內野生櫻資源的建議。張艷芳［7］和朱繼軍分別研究了櫻花的切接繁殖技術和高位嫁接繁育方法。

觀賞櫻花從1991年開始，中國科學院武漢植物研究所做了櫻花組織培養方面的研究并獲得了正常的組培苗；周志堅、張忠民等［8］研究了大島櫻的組織培養與快速繁殖技術，在短時間提供大量適合于生根的壯苗。郭萬里［9］采用器官培養技術探索規模化生產櫻花試管苗的途徑，還分析了規模化生產林木試管苗過程中出現的玻璃化和試管苗弱化（GA引起的徒長）現象以及生產中的對策。福建農林大學付影［10］對鐘花櫻離體繁殖技術體系進行了探索，分別對外植體的表面滅菌、啟動培養、繼代增殖培養、生根培養及煉苗移栽等方面進行了研究，著重探討了組織培養過程中最佳培養基配方及培養程序。

2007年，笠原俊策、韓東生、新美芳二［11］根據Murashige在1974年提出的方法，研究建立一個利用莖尖培養生產日本晚櫻小苗木的系統。在其系統研究中發現，9月為在WPM培養基上外植體最佳切除時間，6月是移栽至盆中的最佳時間，植物將于莖尖培養后4a開花。

1.2櫻花栽培方面的研究

方義昌、王敏、陳先友等研究了葉用、花用櫻花的栽培技術，包括產地環境與規劃、櫻樹園生態建設、土壤管理和施肥、病蟲草害防治、櫻樹修剪與適時采摘等內容，為櫻樹栽培提供了參考。王慧娟、孟月娥等［12］對櫻花的組培苗從基質、肥料濃度及激素3個方面進行了移栽技術方面的研究。結果發現，草炭是櫻花組培苗移栽的最佳基質；連續噴灑5次，每次間隔7d的0.2%的尿素溶液可有效促進組培苗的生長；在植株長出新葉后用赤霉素100mg/L的水溶液噴灑，可以促進植株快速生長，縮短緩苗期。

1.3研究意義

櫻花是深受我國人民喜愛的早春觀賞花木之一。隨著城市園林建設的飛速發展和人們對居住環境要求的日益提高，櫻花在美化環境和滿足人們早春觀賞需求等方面的作用越來越重要。櫻花品種豐富、樹型多樣、葉色變幻、花期整齊，開花盛期持續時間長，是一種不可多得的園林綠化樹種，具有重要的園林應用價值。

據統計，我國現有櫻花品種53個，花色艷麗，白的、粉的、紫的、黃的色彩繽紛，十分引人注目。花瓣有單瓣、半重瓣、重瓣、菊瓣等多種形態，并且整個花期延續期長，葉片的形狀多種多樣，有卵形、披針形等，櫻花大多數的樹形都非常漂亮，樹枝開展，用作庭園或風景區栽植，無論單株栽植、行植及叢植，或植為片林，觀賞效果美不勝收。但是，目前應用中多數景點僅僅只有普通的幾個櫻花品種，園林應用處于較低水平。

櫻花的原產地主要是我國和日本，我國的野生櫻花資源十分豐富，若對這些野生資源加以充分的利用，不僅可以對城市的園林綠化起到推動作用，也會帶來相應的不可忽略的經濟利益。今后應在加強對野生資源保護的同時，加大繁殖生物學研究，尤其是引種、選育工作，加強對野生資源的利用。針對如何以市場為導向，在開發野生資源的基礎上培育出色艷、抗性強的新品種，使得櫻花的物種資源優勢轉變為商品優勢和經濟優勢。

2　名卉公司櫻花研究情況

2.1研究的方法與意義

基于目前的研究現狀，名卉公司運用組織培養的繁育手段，在短時期快速繁殖獲得大量的不同品種的櫻花種苗，滿足櫻花在園林應用中的需求。該研究主要采用植物組織培養技術中的器官培養，探索規模化生產櫻花試管苗的途徑。

在探索規模化生產4個櫻花品種試管苗的過程中，主要采用了腋芽（側芽）誘導方法建立了腋芽誘導培養系。建立了試管苗初代培養，優化了繼代培養和生根培養基，并提出了腋芽誘導規模化生產櫻花試管苗的可行性程序：4個櫻花品種的生長狀態在繼代培養基中差異不明顯，因此可采用一套培養基。但在生根時，它們體現出白身的遺傳差異性。經過試驗，確定了這幾種櫻花品種的生根培養基最佳激素配比范圍，為規模化生產多品種櫻花試管苗提供了生根培養基的激素配比原則。

2.2櫻花組培快繁研究內容

2.2.1櫻花組培快繁體系建立情況。用4個櫻花品種作為名卉公司研究櫻花組培快繁體系的外植體，分別為櫻花1號、櫻花2號、櫻花3號和櫻花4號，以MS培養基為基本培養基進行研發。

2.2.2組培快繁體系的研究方法。2月中旬—4月中旬，采集新發的半木質化的櫻花枝條和較老（木質化程度較高）的櫻花枝條，去除葉片（留部分葉柄3～5mm和枝條頂端幼嫩部分）。櫻花枝條截段長度為1.5～3.0cm，至少含有1個腋芽。用濃洗潔精水溶液振蕩洗滌5min，然后用自來水沖凈洗潔精殘液。預處理后的材料在超凈工作臺中，在75%的酒精中浸泡10～15s，0.1%HgCl溶液中浸泡5～10min，無菌水沖洗3～5遍（3～5min/次），最后將無菌的外植體接種到初代培養基中，接種時露出腋芽。把滅菌的櫻花外植體接種到表l所示的培養基中，卡拉膠0.5%，白糖3%，pH值5.8，25d繼代一次。第15～20天，隨機抽出10～15瓶進行觀察。以外植體腋芽的發生快慢、試管苗生長狀態以及莖底部愈傷大小和狀態來選擇較佳培養基搭配。

繼代培養是把初代培養基C5和C6中新發的外植體接種到表2所示配方中，35d繼代一次。第25～30天，隨機抽出10～15瓶進行觀察。以苗的生長狀態以及莖底部愈傷的大小和狀態來選擇較佳培養基搭配。

表1　櫻花初代培養基配方

表2　櫻花繼代培養基配方

櫻花試管苗生根的優化是把苗接種到生根培養基中（見表3），卡拉膠0.6%，蔗糖2%，pH值5.8，生根苗高度大于1.5cm，截段長度為1.5～2.0cm。培養第15天統計生根率（隨機抽出10～15瓶進行統計和觀察），并觀察苗狀態。

3　研究結果與討論

3.1櫻花組織培養探討

3.1.1櫻花外植體的采集時間。櫻花外植體的采集時間以春天3—4月最佳，這期間花已經開過，新發枝條長度為5～15cm，半木質化，最易誘導掖芽的發生。但過于幼嫩的枝條在葉腋處產生愈傷，會影響腋芽發生；而完全木質化的一年生枝條過于老化，腋芽發生較慢，并且分泌化學物質，進一步影響腋芽的發生，還引起部分腋芽的黃化死亡。

3.1.2基本培養基的選擇。MS、3/4MS和1/2MS基本培養基中，MS不僅延遲了櫻花腋芽的發生時間，約12d腋芽才開始萌動，還抑制了櫻花的生長，莖伸長較慢，葉片較小，處于半卷曲狀態，且葉色黃綠。3/4MS中的櫻花萌動較早，4～6d腋芽就開始膨大萌動。10d就發出一兩片新葉，新葉葉片較大，色澤鮮綠，伸展。1/2MS中的外植體腋芽的萌動時間與3/4MS相似，但葉片淡黃綠色，培養時間稍長（約20d），部分葉片脫落，可能是缺乏某種無機元素或無機元素不足造成的。同時，莖底部愈傷過大，呈白色疏松狀，可能是植物激素用量或配比不當造成的，也可能是有機成分含量過高。因此，櫻花外植體初代培養的建立需要無機離子濃度稍高的基本培養基，但又不能過高，如MS，并且需要多種微量元素。根據結果分析可知，采用3/4MS作為櫻花外植體初代培養的基本培養基是比較合適的。

表3　櫻花生根培養基配方

3.1.3櫻花外植體初代培養基的選擇。無論在MS還是在3/4MS培養基中，當NAA濃度不變時，外植體底部愈傷隨6-BA濃度的降低而減小，顏色由淺黃疏松到黃綠堅實。而且新發的幼枝長勢差異隨6-BA濃度（0.5～1.5mg/L）的變化并不顯著。這說明6-BA濃度過高時促進了無效愈傷的形成，而對幼苗長勢并無較大的影響。因此，在櫻花外植體初代培養系建立時，以不影響新芽生長為原則，選擇較低的6-BA濃度。由以上試驗和分析，C6較適合幼嫩櫻花外植體的初代培養。

3.1.4櫻花繼代培養基的選擇。根據櫻花初代培養基初選試驗的結果，選擇了3/4MS做基本培養基，并對6-BA和NAA作了調整。從6-BA和NAA的配比中可看到，除愈傷有差異外，Jl～J4中的櫻花繼代苗狀態差別不大。但從總體試管苗的整齊性來看，J2最好（很可能6-BA和NAA的配比最適合櫻花試管苗的繼代）。因此，為了櫻花生產中繼代周期的一致性并便于操作，櫻花試管苗生產中的繼代前期培養基選擇J2較合適。但隨著繼代代數的增加繼代苗弱化，要把NAA和6-BA濃度兩者進行調配，根據試驗和實際生產情況，櫻花試管苗生產中的繼代培養基選擇J5較合適。

3.1.5櫻花試管苗生根培養基的優化。從表4來看，S1～S7為單加NAA試驗，其濃度范圍是0.05～0.60mg/L。很明顯，隨著NAA濃度的升高，櫻花生根率明顯上升，為29.5%～95.5%；但不能太高，當濃度NAA大于0.50mg/L時生根率下降，櫻花莖底部愈傷顯著增大呈松散白色。這很可能是高濃度NAA促進了愈傷的發生而抑制根的發生。因此，高濃度NAA不適合櫻花生根。從試驗結果來看，NAA對櫻花試管苗生根有較好的促進作用，但最佳使用范圍應不高于0.50mg/L，且根較粗壯，有少量愈傷。

S8～S14為單加ΙAA的試驗，其濃度范圍是0.05～0.60mg/L。隨著ΙAA濃度的升高，櫻花莖底部的愈傷有增大的趨勢，但明顯沒有NAA愈傷大，只有ΙAA （0.60mg/L）的愈傷明顯過大，并且生根率也最低（31.0%）。在此范圍內，生根率先緩慢升高后又降低。說明ΙAA濃度在一定范圍內（0.00～0.40mg/L）可能具有促進生根的能力。大于0.40mg/L，則促進了愈傷的生長，抑制了根的發生。因此，可把ΙAA濃度控制在0.00～0.40mg/L范圍內。

S15～S21為單加ΙBA的試驗，其濃度范圍是0.05～0.60mg/L。從表4中可以看到，同濃度的NAA、ΙAA和ΙBA對櫻花試管苗生根的影響中，ΙBA中苗的愈傷塊大小處于NAA和ΙAA之間，愈傷塊的大小隨ΙBA濃度的升高而略有升高，而愈傷塊的增大并沒有影響生根率上升的趨勢。所以，在此范圍內單獨使用ΙBA對櫻花試管苗生根有促進作用，但根較細長而易折斷。

綜合上述分析，3種生長素對櫻花試管苗根發生的影響效果為NAA＞ΙBA＞ΙAA。單獨使用NAA、ΙAA 和ΙBA時，各培養基間生根率差異較大。ΙAA的促進效果較差，愈傷大，生根率低；ΙBA的促進生根效果較好，愈傷較小，但根細長易折斷，在實際生產中出瓶時移栽的損耗較大，從而降低了成活率。NAA雖有刺激愈傷發生的作用，但是只要把握好使用濃度，生根效果顯著且根系較粗壯、韌性好，更有利于克服出瓶損耗。綜合表4中各培養基生根率和愈傷塊大小以及生產實際來看，S6更適合于櫻花生根和生產。

表4 　櫻花生根統計表

表5　櫻花移栽成活率

3.2櫻花組培苗移栽技術探討

櫻花試管苗移栽以德國進口KLASMAN泥炭土作為基本基質。櫻花試管苗在生根培養基中培養30d，移至溫室中煉苗3～5d，移栽到泥炭土基質中，并在苗上方搭遮蔭網，以免陽光灼傷幼苗。栽培溫度18～26℃，保持基質濕潤。15d后去除遮蔭網，30d統計成活率。櫻花1號、櫻花2號、櫻花3號和櫻花4號的移栽情況如表5所示。

從表5可看出，櫻花在泥炭土基質中的成活率相當高，都在90%以上，說明這種基質適合櫻花大規模栽培。

4　結論

從以上試驗可得出，規模化生產4個品種櫻花試管苗過程中所用到的培養基，C6［3/4MS+6-BA（0.50mg/L）+ NAA（0.02mg/L）］培養基可用于外植體的初代培養和前期繼代，正常的繼代以J5［3/4MS+6-BA（0.30mg/L）+ NAA（0.01mg/L）］培養基為佳（繼代周期為30～35d）。

S6［1/2MS+NAA（0.50mg/L）+AC］可用于生根培養。在組織培養過程中，櫻花的遺傳差異主要表現在生根方面。根據試驗，縮小了激素的選擇范圍，即生長素濃度應不超過0.50mg/L，盡量不用ΙAA，而用ΙBA或者NAA或者是混合使用。這樣對每個品種都能較快地確定其最佳生根培養基。相對來說，櫻花試管苗的栽培還是比較容易的，4個櫻花品種試管苗在泥炭土的基質上成活率都能達到90%以上。以上這一系列的培養基可根據櫻花試管苗在規模化生產中所處的不同狀態來進行相應調整。

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1674-7909（2016）08-06-5