川西藏區(qū)天然野櫻桃酒中有機(jī)酸含量檢測(cè)方法的構(gòu)建

盧倩文，蔡　婷，秦　佳，康　輝，趙婷婷，張楠笛，向文良*

（1.西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川省食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西華大學(xué)古法發(fā)酵（釀造）生物技術(shù)研究所，四川 成都610039；2.小金縣夾金山天然野櫻桃酒業(yè)有限公司，四川 阿壩 624000）

川西藏區(qū)天然野櫻桃酒中有機(jī)酸含量檢測(cè)方法的構(gòu)建

盧倩文1，蔡婷1，秦佳2，康輝2，趙婷婷1，張楠笛1，向文良1*

（1.西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川省食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西華大學(xué)古法發(fā)酵（釀造）生物技術(shù)研究所，四川 成都610039；2.小金縣夾金山天然野櫻桃酒業(yè)有限公司，四川 阿壩 624000）

建立高效液相色譜（HPLC）法對(duì)川西藏區(qū)天然野櫻桃酒中有機(jī)酸的種類(lèi)和含量的檢測(cè)方法。采用Aminex HPX-87H離子排阻色譜柱，以7 mmol/L H2SO4溶液（pH 2.20）為流動(dòng)相，流速為0.6 mL/min，柱溫60℃，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，該檢測(cè)方法重現(xiàn)性好、精密度及準(zhǔn)確度高，在0.001～2.000 g/L線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2＞0.99），檢出限為0.000 6 g/L，加標(biāo)回收率為86%～106%，重現(xiàn)性試驗(yàn)、精密度試驗(yàn)和回收率試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均＜5%，適用于天然野櫻桃酒中6種重要有機(jī)酸的同時(shí)檢測(cè)。結(jié)果表明，川西藏區(qū)天然野櫻桃酒樣品中含量最高的有機(jī)酸是草酸（1.92 g/L）和L-蘋(píng)果酸（0.78 g/L），其次是乙酸（0.17 g/L）和酒石酸（0.18 g/L），乳酸（0.15 g/L）和檸檬酸（0.15 g/L）含量最少。

高效液相色譜法；天然野櫻桃酒；有機(jī)酸；檢測(cè)

野櫻桃（Cerasus tomentosa（Thunb.）Wall.）為薔薇科落葉灌木，其果實(shí)不僅味道鮮美而且營(yíng)養(yǎng)成分豐富；富含維生素C、各種氨基酸、花色素、糖，礦物質(zhì)鋅、鐵、鉀、錳、銅等，其中含鐵量居水果首位［1-2］。四川阿壩藏區(qū)氣候冷涼干燥、日照強(qiáng)烈，晝夜溫差大，野櫻桃分布十分廣泛，在海拔3 500 m左右均有自然生長(zhǎng)，樹(shù)勢(shì)健壯，病蟲(chóng)危害極少，深受消費(fèi)者的青睞。但野櫻桃季節(jié)性強(qiáng)，收獲期短，一般為10～15 d［3］，并且在室溫下不耐貯藏，因此對(duì)其進(jìn)行深加工以延長(zhǎng)貨架期顯得十分重要。將野櫻桃開(kāi)發(fā)成具有高附加值的野櫻桃酒，不僅可保留野櫻桃的大部分營(yíng)養(yǎng)成分，延長(zhǎng)野櫻桃的貨架期，而且符合糧食酒向果酒轉(zhuǎn)變的國(guó)家酒類(lèi)行業(yè)政策，又符合追求天然、含糖量少、酒精度低且有益于健康的果酒世界飲酒潮流［4-5］。

以科學(xué)方法釀造而成的野櫻桃果酒中，含有豐富的有機(jī)酸，其種類(lèi)和含量直接影響到野櫻桃酒的口感和質(zhì)量，還影響到野櫻桃酒的顏色和陳釀效果［6-8］。因此建立一種分析和測(cè)定野櫻桃酒中有機(jī)酸的方法，對(duì)野櫻桃酒的生產(chǎn)和研發(fā)具有重要意義。目前，果汁和果酒中有機(jī)酸的分析方法主要有滴定法、比色法、酶法、氣相色譜法、離子色譜法、毛細(xì)管電泳法和高效液相色譜（high performance liq-uid chromatography，HPLC）法等，其中滴定法［9］、比色法［10］、酶法［9-10］影響因素較多，準(zhǔn)確度較差；氣相色譜法［11］樣品前處理繁瑣費(fèi)時(shí)；離子色譜［12］不適合做復(fù)雜的樣品分析；毛細(xì)管電泳法［13］重現(xiàn)性存在明顯不足；HPLC法［14-15］是目前有機(jī)酸分析中最成熟、也最常用的方法。

本試驗(yàn)旨在以采摘于川西藏區(qū)的天然野櫻桃為原料，通過(guò)發(fā)酵工藝制備天然野櫻桃果酒，優(yōu)化色譜條件，建立一種更加方便、快捷的針對(duì)川西藏區(qū)天然野櫻桃酒中6種重要有機(jī)酸（草酸、酒石酸、L-蘋(píng)果酸、乙酸、乳酸和檸檬酸）的高效液相色譜法，為野櫻桃的精深加工和優(yōu)化野櫻桃果酒工藝奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

天然野櫻桃：采摘于川西藏區(qū)（阿壩州小金縣）；天然野櫻桃果酒：西華大學(xué)古法發(fā)酵生物技術(shù)研究所釀造。

蔗糖：市售一級(jí)；果膠酶（酶活力10 000 U/g）：美國(guó)Sigma公司；果酒酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；皂土、硅藻土：廣州市喜億隴貿(mào)易有限公司；過(guò)氧酸：西隴化工股份有限公司；氯化鈉（分析純）：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；草酸、酒石酸（均為色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；L-蘋(píng)果酸、檸檬酸（均為色譜純）：成都西亞試劑有限公司；乙酸、乳酸（均為色譜純）：成都華夏化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸（分析純）：重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

LPS-5離心式破碎機(jī)：旭郎機(jī)械成都分公司；WBL25C56榨汁機(jī)：美的（Midea）集團(tuán)股份有限公司；5L發(fā)酵罐、陳釀罐：鎮(zhèn)江匯能達(dá)生物工程設(shè)備有限公司；SW-CJ-2F雙人潔面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；JA2003電子天平：舜宇恒平儀器有限公司；pHS-3C酸度計(jì)：成都世紀(jì)方舟科技有限公司；Waters2698高效液相色譜儀（2695紫外檢測(cè)器）：美國(guó)Waters公司；Aminex HPX-87H離子排阻色譜柱：BIO-RAD公司；UPH-Ⅱ-5T超純水機(jī)：四川優(yōu)普超純科技有限公司。

1.3方法

1.3.1野櫻桃果酒加工工藝流程及操作要點(diǎn)［16-18］

操作要點(diǎn)：

原材料預(yù)處理：挑選新鮮、顏色鮮紅、成熟度高、無(wú)腐爛的野櫻桃為原料，用流速為5 m3/h的流動(dòng)清水洗凈后，再用0.2%～0.3%過(guò)氧酸殺菌水溶液浸泡1 min后，用流動(dòng)清水清洗，瀝水40～50 min。

添加SO2及果膠酶處理：為抑制雜菌的生長(zhǎng)繁殖，野櫻桃打漿后應(yīng)立即添加0.10～0.15 g/L SO2（120 mg/L的偏重亞流酸鉀）。添加SO2約5 h后再添加0.1～0.3 g/L果膠酶（10 000 U/g）增強(qiáng)澄清效果和提高出汁率，果膠酶可以軟化果肉組織中的果膠物質(zhì)，使之分解生成半乳糖醛酸和果膠酸，使果汁中的固形物失去依托而沉降下來(lái)。

調(diào)配：添加蔗糖調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基中的糖含量為17%～20%，用檸檬酸將培養(yǎng)基的pH值調(diào)至4.0～5.0。

發(fā)酵：將成分調(diào)整好的發(fā)酵液置于發(fā)酵罐中，然后加入0.03%的酵母菌進(jìn)行發(fā)酵主發(fā)酵溫度為24～28℃，時(shí)間為16 d，后發(fā)酵溫度為16℃，發(fā)酵時(shí)間為28 d。

澄清處理：野櫻桃果酒用0.2～0.4 g/L的皂土進(jìn)行下膠處理，7～8 d后進(jìn)行轉(zhuǎn)罐，同時(shí)采用硅藻土過(guò)濾，再將澄清處理后的果酒采用錯(cuò)流膜過(guò)濾系統(tǒng)處理，操作參數(shù)為：透膜壓差0.13～0.15 MPa，錯(cuò)流切向速度4～6 m/s，過(guò)濾時(shí)間1～2 h，酒液溫度-0.5～-0.1℃和反沖間隔2～4 min。

陳釀：將澄清處理后的酒液在12～15℃陳釀3～6個(gè)月，使成品的風(fēng)味得到改善，形成典型的野櫻桃果酒風(fēng)味。

1.3.2高效液相法檢測(cè)色譜條件

色譜柱：Aminex HPX-87H離子排阻色譜柱（300 mm× 7.8 mm，9 μm），流動(dòng)相：7 mmol/L的H2SO4溶液（pH值為2.20），流速：0.6 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm，柱溫：60℃，進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.3樣品預(yù)處理及標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

樣品預(yù)處理：取一定量的成品野櫻桃酒經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，收集濾液待測(cè)。

有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液：分別稱(chēng)取草酸、酒石酸、L-蘋(píng)果酸、乙酸、乳酸和檸檬酸各0.5 g，加超純水溶解并分別定容到50 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為1 g/L的6種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，作為定性工作液使用。

有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液：分別精密稱(chēng)取草酸0.201 0 g、酒石酸0.100 2 g、L-蘋(píng)果酸0.101 2 g、乙酸0.100 3 g、乳酸0.101 1 g、檸檬酸0.101 4 g用超純水溶解于同一燒杯中，定容到100 mL容量瓶中，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，作為定量工作液使用。

1.3.4定性定量方法

定性方法：分別將6種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品按照1.3.2的色譜條件進(jìn)行分析，以出峰時(shí)間定性確定不同的有機(jī)酸。

定量方法：將處理好的樣品按照1.3.2的色譜條件進(jìn)行分析，以出峰面積定量確定不同有機(jī)酸的含量。

2　結(jié)果與分析

2.1色譜條件的確定

2.1.1檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

取有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行光譜掃描，掃描結(jié)果見(jiàn)圖1，結(jié)果表明，6種有機(jī)酸在210 nm附近有較大的吸收，重復(fù)性好，且硫酸溶液在波長(zhǎng)210 nm處幾乎沒(méi)有紫外吸收，故采用210 nm的紫外波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。

圖1　有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收光譜掃描圖Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum scannogram of organic acids standard substance

2.1.2色譜柱的選擇

在果酒中有機(jī)酸的檢測(cè)中，色譜柱的選擇尤為關(guān)鍵，相關(guān)文獻(xiàn)中使用C18較多，為了使有機(jī)酸的分離效果較好，常常在流動(dòng)相中要加入一定比例的有機(jī)溶劑，如甲醇和乙腈，這使色譜條件變得比較繁瑣［19-20］。本研究采用Aminex HPX-87H離子排阻色譜柱，該色譜柱是檢測(cè)有機(jī)酸的專(zhuān)用柱，相比于C18柱而言，不僅可以在短時(shí)間內(nèi)有效地分離多種有機(jī)酸，而且所需的流動(dòng)相種類(lèi)單一，大大簡(jiǎn)化了色譜條件的選擇工作，提高了檢測(cè)效率［21-22］。

2.1.3柱溫及流動(dòng)相中H2SO4濃度的確定

圖2　有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)品（A）及野櫻桃果酒樣品（B）的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of organic acids mixed standards（A）and the wild cherry wine sample（B）

柱溫和流動(dòng)相的離子強(qiáng)度對(duì)于有機(jī)酸的分離效果有著明顯的影響［23-24］。研究了柱溫和H2SO4濃度對(duì)于草酸、酒石酸、L-蘋(píng)果酸、乙酸、乳酸和檸檬酸的分離效果的影響。其中分別選擇45℃、50℃、55℃、60℃、65℃柱溫條件，結(jié)果表明，隨著溫度的升高，6種有機(jī)酸的分離度增加，但當(dāng)溫度超過(guò)60℃時(shí)，基線漂移嚴(yán)重，因此選擇60℃作為測(cè)試柱溫，可以有效實(shí)現(xiàn)6種有機(jī)酸的分離。其他條件不變，考察了不同H2SO4濃度（3 mmol/L、5 mmol/L、7 mmol/L、9 mmol/L）對(duì)6種有機(jī)酸分離效果的影響，結(jié)果表明，當(dāng)H2SO4的濃度為7 mmol/L時(shí)，對(duì)6種有機(jī)酸的分離達(dá)到定量要求，有機(jī)酸混合標(biāo)品及野櫻桃果酒樣品的高效液相色譜圖見(jiàn)圖2。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

根據(jù)1.3.3方法配制不同濃度有機(jī)酸混合對(duì)照溶液在優(yōu)化色譜條件下，分別以5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL體積進(jìn)樣，記錄峰面積。以有機(jī)酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及線性范圍Table 1 Regression equation and linear range of standard curves

由表1可知，6種有機(jī)酸的相關(guān)系數(shù)R2均＞0.99，表明峰面積和有機(jī)酸組分質(zhì)量濃度的線性相關(guān)性良好。

2.3HPLC檢測(cè)方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸酸樣品平行測(cè)定5次，測(cè)定其峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見(jiàn)表2。6種有機(jī)酸保留時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.09～0.18，RSD均＜2%，表明該方法具有較好的重現(xiàn)性。

表2　重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of repeatability experiments

2.3.2精密度試驗(yàn)

取6種有機(jī)酸標(biāo)品混合溶液5 mL，按照優(yōu)化色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，分別計(jì)算各有機(jī)酸峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，6種有機(jī)酸檢測(cè)結(jié)果RSD均＜2%，表明該方法精密度較好。

表3　精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of precision experiments

2.3.3回收率試驗(yàn)

取成品野櫻桃果酒4份，其中1份作為本底，另3份分別添加高、中、低濃度的草酸、酒石酸、L-蘋(píng)果酸、乙酸、乳酸、檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)液，進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，該方法的回收率在87%～106%之間，RSD均＜3%，表明該方法準(zhǔn)確度較好。

表4　加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of adding standard recovery rate experiments

2.4天然野櫻桃酒中有機(jī)酸的檢測(cè)

制備野櫻桃果酒，按照優(yōu)化色譜條件進(jìn)樣，設(shè)3次重復(fù)，測(cè)定野櫻桃酒中有機(jī)酸的含量。結(jié)果表明，天然野櫻桃酒中有機(jī)酸以草酸和L-蘋(píng)果酸為主，占總酸含量的80.8%，質(zhì)量濃度分別為1.920 g/L、0.778 g/L，其中檸檬酸0.145 g/L、酒石酸0.179 g/L、乳酸0.148 g/L、乙酸0.169g/L。野櫻桃酒中有機(jī)酸的含量由高到低依次為：草酸＞L-蘋(píng)果酸＞酒石酸＞乙酸＞乳酸＞檸檬酸。

3　結(jié)論

以采摘川西藏區(qū)生長(zhǎng)的天然野櫻桃為原料，經(jīng)過(guò)釀造發(fā)酵得到天然野櫻桃果酒，利用HPLC法檢測(cè)到成品酒中草酸、檸檬酸、酒石酸、L-蘋(píng)果酸、乳酸和冰乙酸的含量分別為1.920 g/L、0.145 g/L、0.179 g/L、0.778 g/L、0.148 g/L和0.169 g/L。本試驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器，Aminex HPX-87H離子排阻色譜柱，以7mmol/L的H2SO4溶液（pH值為2.20）為流動(dòng)相，流速為0.6 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫60℃，6種有機(jī)酸在15 min內(nèi)得到有效分離和定量。本檢測(cè)方法樣品前處理方法簡(jiǎn)單，建立了一種快速、便捷、高效測(cè)定野櫻桃酒中有機(jī)酸的方法，在0.001～2.000 g/L線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2＞0.99），檢出限為0.000 6 g/L，加標(biāo)回收率為86%～106%，重現(xiàn)性、精密度和加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均＜5%。同時(shí)，對(duì)川西藏區(qū)的天然野櫻桃中的6種主要有機(jī)酸進(jìn)行了定量分析，這對(duì)川西藏區(qū)天然野櫻桃的后續(xù)加工中的品質(zhì)控制提供了一定參考。

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Establishment of detection method of organic acids contents in natural wild cherry wine in western Sichuan Tibetan areas

LU Qianwen1，CAI Ting1，QIN Jia2，KANG Hui2，ZHAO Tingting1，ZHANG Nandi1，XIANG Wenliang1*（1.Provincial Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan，Institute of Ancient Brewing Technology，College of Food and Bioengineering，Xihua University，Chengdu 610039，China；2.Xiaojin Jiajin Natural Wild Cherry Wine Co.，Ltd.，Aba 624000，China）

A HPLC method for determination of different kinds and contents of organic acids in natural wild cherry wine from western Sichuan Tibetan areas was established.Using Aminex HPX-87H ion exclusion chromatography column，7 mmol/L H2SO4as mobile phase，flow rate 0.6 ml/min，column temperature 60℃and detection wavelength 210 nm，the organic acids was determined by HPLC.Through the methodology validation，the detection method had good reproducibility，high precision and accuracy.The method had a good linear relationship in the range of 0.001-2.000 g/L，the limit of determination was 0.000 6 g/L，the adding standard recovery rate was 86%-106%，the relative standard deviation of reproducibility，precision and recovery rate experiments was all less than 5%，which indicated that the method was suitable for simultaneous detection of six kinds of important organic acids in natural wild cherry wine.The results showed that the highest contents of organic acids in natural wild cherry wine from western Sichuan Tibetan areas were oxalic acid（1.92 g/L）and L-malic acid（0.78 g/L），followed by acetic acid（0.17 g/L）and tartaric acid（0.18 g/L），the contents of lactic acid（0.15 g/L）and citric acid（0.15 g/L）were the lowest.

HPLC；natural wild cherry wine；organic acids；detection

TS262.7

0254-5071（2016）09-0154-05doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.035

2016-04-26

教育部春暉計(jì)劃項(xiàng)目（Z2014061）；四川省應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目（2014JY0045）；四川省科技支撐計(jì)劃（2016FZ0023）；四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（14ZA0110；14Z0107）

盧倩文（1992-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸锓肿由鷳B(tài)。

向文良（1973-），男，教授，博士，研究方向?yàn)橹袊?guó)西南地區(qū)特色發(fā)酵食品微生物分子生態(tài)與生物過(guò)程學(xué)。