中心組合設計優(yōu)化野葛糖化工藝

褚　沖，姚尚杰，黃　鈞，吳重德，周榮清，2*

（1.四川大學 輕紡與食品學院，四川 成都 610065；2.四川大學 制革清潔技術國家工程實驗室，四川 成都 610065）

中心組合設計優(yōu)化野葛糖化工藝

褚沖1，姚尚杰1，黃鈞1，吳重德1，周榮清1，2*

（1.四川大學 輕紡與食品學院，四川 成都 610065；2.四川大學 制革清潔技術國家工程實驗室，四川 成都 610065）

以野葛為原料，采用葡萄糖當量值（DE值）為評價指標，在單因素試驗的基礎上，利用中心組合設計試驗優(yōu)化野葛糖化工藝條件并建立回歸方程。結果表明，野葛糖化的最佳工藝參數(shù)依次為酶解時間220 min、pH 4.2、酶添加量528 U/g、酶解溫度58℃。在此工藝條件下糖化液DE值可達到（79.93±0.20）%。

野葛；糖化；葡萄糖當量值；中心組合設計

野葛〔Pueraria lobata（Willd.）Ohwi〕別名甘葛、葛藤等，為豆科葛屬多年生草質藤本植物，也是我國衛(wèi)生部公布的藥食同源植物，極富開發(fā)價值［1］。野葛中含有大量淀粉，也富含鈣、磷、鉀、鐵、鋅等多種人體所必需的礦質元素。野葛的主要功效成分有葛根素、大豆苷、蘆丁等異黃酮類物質，因此具有很高的食用和藥用價值，已成為開發(fā)新型保健食品的首選原料之一［2-3］，各式各樣的野葛保健功能食品也陸續(xù)問世［4-6］。目前，雖然廣泛研究了野葛中黃酮類、淀粉的提取工藝［7-9］，但仍然缺乏合理利用的相關研究，其淀粉常作為廢棄物而被直接丟棄，使得這些資源未被合理利用。基于野葛淀粉特性的酶解工藝可為野葛資源的合理利用奠定重要基礎，以富含淀粉的野葛為原料發(fā)酵生產功能性保健酒，同時實現(xiàn)葛根素、黃酮類與淀粉的共用。

響應面分析法（response surface methodology，RSM）是一種能有效優(yōu)化工藝過程參數(shù)的分析方法［10-11］。該方法通過研究各因素及其交互作用的特點選擇合適的試驗設計，并對其結果進行回歸分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，進而揭示其關鍵變量的貢獻度并且預測其影響規(guī)律［12-14］。本試驗以野葛作為研究對象，通過單因素試驗初步探討各因素對葡萄糖當量值（dextrose equivalent，DE）的影響規(guī)律后，再運用中心組合設計試驗分析并建立回歸模型，以期得到最佳的酶解工藝條件，同時也為野葛酶解工藝的進一步開發(fā)提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

野葛：市售，高速粉碎后過40目篩儲藏備用；液化酶（酶活力126 000 U/g）、糖化酶（酶活力240 000 U/g）：諾維信生物技術有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2儀器與設備

PHS-3C精密酸度計：上海儀電科學儀器股份有限公司；WZS-18手持式折射儀：上海儀電物理光學儀器有限公司；DZKW-4電子恒溫水浴鍋：北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1工藝流程

1.3.2野葛液化液的制備

取野葛粉5.00 g置于150 mL三角瓶中，按料液比1∶10（g∶mL）沸水浴加熱30 min糊化；待溫度降至65℃，α-淀粉酶用量為25.2 U/g，恒溫酶解36 min。得野葛液化液。

1.3.3糖化單因素試驗

酶解時間的確定：液化液pH調至4.5，糖化酶用量為432 U/g，置于60℃水浴中，分別保溫120 min、140 min、160 min、180 min、200 min、220 min、240 min，滅活測定其DE值。

pH的確定：分別將液化液pH調至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，糖化酶用量為432 U/g，置于60℃水浴保溫180 min，滅活測定其DE值。

酶添加量的確定：液化液pH調節(jié)至4.5，酶添加量分別為288 U/g、336 U/g、384 U/g、432 U/g、480 U/g、528 U/g、576 U/g，置于60℃水浴保溫180 min，滅活測定其DE值。

酶解溫度的確定：液化液pH調至4.5，以酶添加量432U/g加入糖化酶，分別置于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃水浴保溫180 min，滅活測定其DE值。

1.3.4糖化工藝響應面優(yōu)化

在單因素試驗的基礎上，運用Design-Expert 8.0.5b軟件，采用中心組合設計［15］優(yōu)化野葛糖化工藝參數(shù)；分別以A（酶解時間）、B（pH）、C（酶添加量）、D（酶解溫度）作為自變量，每個自變量水平分別以-2、-1、0、1、2進行編碼；試驗因素編碼及水平見表1。以DE值（Y）作為響應值，設計4因素5水平的糖化響應面試驗，建立回歸方程以確定最優(yōu)糖化工藝條件。

表1　中心組合設計因素與水平Table 1 Factors and levels of central composite design

1.3.5測定方法

還原糖測定：斐林試劑滴定法［16］。

可溶性固形物：手持式折射儀測量［17］。

2　結果與分析

2.1野葛液化液的制備

采用1.3.3所述條件，α-淀粉酶液化后，DE值達到（19.16± 0.38）%。試驗結果表明，該液化條件達到進一步糖化要求。液化后的DE值處于15%～20%較合適，液化液DE值過高，不利于糖化酶與底物形成絡合結構，降低糖化效率；而DE值過低，液化后產物凝聚性強，易于重新結合，也不利于后續(xù)糖化［19］。

2.2單因素試驗結果與分析

2.2.1酶解時間對DE值的影響

由圖1可知，隨著酶解時間的延長，糖化液DE值逐漸增大，180 min后，DE值增加緩慢并趨于穩(wěn)定。與在糖化初階段，糖化酶作用于α-1，4糖苷鍵或α-1，6糖苷鍵將糊精、低聚糖等衍生物水解為單糖，DE值增加明顯。隨著酶促催化反應的進行，產物的抑制作用以及產物間的重新聚合使得DE值在180 min后趨于穩(wěn)定［20］。因此，選擇酶解時間為180 min。

圖1　酶解時間對糖化液DE值的影響Fig.1 Effect of enzymolysis time on DE value of saccharified solution

2.2.2pH對DE值的影響

由圖2可知，糖化液pH從3.0增加到4.5時，其DE值逐漸提高，在pH達到4.5時達到峰值（72.89±0.11）%，繼續(xù)增加糖化液pH，DE值反而降低。pH會影響酶活性基團的解離狀態(tài)和酶活性中心的構象，從而影響酶與底物的結合力和催化能力［21］。水解環(huán)境酸或堿性過強均會影響酶的活力，使酶作用下降，DE值減少。因此，選擇糖化液的最適pH值為4.5。

圖2　pH對糖化液DE值的影響Fig.2 Effect of pH on DE value of saccharified solution

2.2.3酶添加量對DE值的影響

由圖3可知，糖化酶添加量＜432 U/g時，糖化液DE值隨酶添加量的增加呈現(xiàn)出逐漸增大的趨勢；繼續(xù)增大酶添加量，未觀察到DE值有顯著的增加。該酶添加量與紫甘薯、木薯的糖化酶添加量相比偏大，可能和野葛淀粉的結構與組成異于其他類型淀粉有關［22-24］，同時酶和底物可能存在著適當?shù)谋壤龃竺柑砑恿坎⑽词沟肈E值顯著提高［15］。此外，酶添加量過大也造成酶的浪費。因此，選用酶添加量為432 U/g。

圖3　酶添加量對糖化液DE值的影響Fig.3 Effect of glucoamylase addition on DE value of saccharified solution

2.2.4酶解溫度對DE值的影響

由圖4可知，酶解溫度從40℃逐步提高至60℃，酶解速率顯著增加；在酶解溫度為60℃時，糖化液DE值達到峰值；繼續(xù)提高酶解溫度，DE值下降明顯。40～60℃時，溫度升高增加了單位時間內酶分子與底物的有效碰撞次數(shù)，反應速率增加，DE值提高。而酶解溫度過高則改變了糖化酶的催化活性，致使酶解作用減弱［21］。因此，選擇最佳酶解溫度為60℃。

圖4　酶解溫度對糖化液DE值的影響Fig.4 Effect of temperature on DE value of saccharified solution

2.3響應面法優(yōu)化試驗結果與分析

2.3.1中心組合設計方案及結果分析

以酶解時間（A）、pH（B）、酶添加量（C）、酶解溫度（D）為自變量，以DE值（Y）為響應值，運用中心組合設計進行響應面試驗，共30組，試驗方案及結果見表2。

表2　中心組合設計方案及結果Table 2 Scheme and results of central composite design

2.3.2回歸模型擬合及方差分析

對所有試驗數(shù)據(jù)（表2）經(jīng)Design Expert 8.0.5b軟件進行回歸擬合，得回歸方程：

Y=78.78+0.56A-0.15B+0.25C+0.30D-0.25AB-0.077AC-0.085AD+0.046BC+0.085BD-0.23CD-0.095A2-0.55B2+0.059C2-0.48D2。

該模型的方差分析見表3，回歸模型高度顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P＞0.05），方程不失擬，模型在回歸區(qū)域內擬合較好。決定系數(shù)R2=0.894 0，表明該模型相關性良好。離散系數(shù)（coefficient of variance，CV）越大，試驗結果的可靠性和精確度越低，本試驗CV=0.60%，結果可靠。該回歸模型中精確度為10.068（＞4），數(shù)值可靠，模型可用于回歸分析。

各因素對野葛糖化液DE值的影響順序為：A（酶解時間）＞D（酶解溫度）＞C（酶添加量）＞B（pH）；從回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知，一次項A（酶解時間）、D（酶解溫度）以及二次項B2、D2表現(xiàn)為極顯著（P＜0.01），一次項C（酶添加量）和交互項AB表現(xiàn)為顯著（0.01＜P＜0.05）；交互作用中只有酶解時間和pH表現(xiàn)為顯著，余下的交互項作用并不顯著。

表3　回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

2.3.3因素的交互作用對野葛糖化液DE值的影響

交互作用對響應值的影響可以通過等高線圖和響應面圖直觀的反映出來，等高線圖的形狀反映交互作用的強弱。響應面圖與等高線圖相對應，橢圓表示交互作用顯著，而圓形則表示交互作用不顯著。

由圖5可知，等高線沿pH軸向變化相對密集，pH對糖化液DE值的影響比酶解時間大，酶解時間和pH相互作用顯著。在一定范圍內，DE值隨著酶解時間和pH的增大而增大；呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。等高線分別沿pH和酶解溫度軸變化的密集程度大致一致，pH和酶解溫度對DE值的影響程度相近，相互作用不顯著。當pH、酶解溫度均較低時，DE值較低；隨著pH和酶解溫度的升高，糖化液DE值先緩慢升高，達到最大值后逐漸下降。等高線沿溫度軸變化相對密集，說明酶解溫度對DE值的影響比酶解時間大。在一定范圍內，DE值隨著酶解時間和溫度增大而增大；隨著酶解時間和溫度的增大，DE值呈先升高后降低的趨勢。

圖5　酶解時間、pH及溫度交互作用對糖化液DE值影響的響應曲面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects ofinteraction between enzymolysis time，pH andtemperature on DE value of saccharified solution

2.4驗證試驗

對二次回歸模型進行響應面分析，確定最佳工藝參數(shù)為：酶解時間220 min，pH 4.23，酶添加量528 U/g，酶解溫度58.04℃；在此條件下的預測糖化液DE值為80.17%。根據(jù)試驗的可操作性，將糖化的工藝參數(shù)調整為：酶解時間220 min，pH 4.2，酶添加量528 U/g，酶解溫度58℃。此條件下重復試驗3次，糖化液的DE實測平均值為（79.93± 0.20）%，與預測值接近，說明采用此響應面優(yōu)化模型得到的工藝參數(shù)可靠。

3　結論

本試驗對野葛的糖化工藝進行了研究，考察不同因素對野葛糖化的影響。采用中心組合設計進行響應面分析得到各因素對野葛糖化的影響大小依次為：酶解時間、溫度、酶添加量、pH，最佳糖化條件為：酶解時間220 min，pH 4.2，酶添加量528 U/g，酶解溫度58℃。在此條件下，酶解得到的糖化液DE值達到（79.90±0.20）%，與預測值80.17%接近。該模型能較好的預測野葛糖化條件與DE值的關系，證明中心組合設計優(yōu)化野葛糖化工藝的可行性，為功能性保健酒的后續(xù)發(fā)酵及野葛的相關開發(fā)奠定基礎。

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Optimization of saccharification conditions ofPueraria lobata（Willd.）Ohwi with central composite design

CHU Chong1，YAO Shangjie1，HUANG Jun1，WU Chongde1，ZHOU Rongqing1，2*
（1.College of Light Industry，Textile&Food，Sichuan University，Chengdu 610065，China；2.National Engineering Laboratory for Clean Technology of Leather Production，Chengdu 610065，China）

UsingPueraria lobata（Willd.）Ohwi as raw material，the saccharification process was optimized by single-factor experiment，and based on this，the optimal sacchari fication conditions and quadratic regression equation were established by central composite design.The optimal saccharification conditions were obtained as follows：enzymolysis time 220 min，pH 4.2，glucoamylase addition 528 U/g，temperature 58℃.Under the conditions，the DE value of saccharification mash could achieve（79.93±0.20）%.

Pueraria lobata（Willd.）Ohwi；saccharification；dextrose equivalent value；central composite design

TS218

0254-5071（2016）09-0145-05doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.033

2016-06-14

褚沖（1991-），男，碩士研究生，研究方向為現(xiàn)代發(fā)酵技術。

周榮清（1960-），男，教授，博士，研究方向為現(xiàn)代發(fā)酵技術和酶工程及其應用。