衡水老白干酒指紋圖譜的單向多元方差分析

姜東明，李澤霞，張福艷，王　敏，張煜行*

（1.河北衡水老白干酒業(yè)股份有限公司，河北 衡水 053000；2.河北省白酒釀造工程技術(shù)研究中心，河北 衡水 053000；3.衡水學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 衡水 053000）

衡水老白干酒指紋圖譜的單向多元方差分析

姜東明1，2，李澤霞1，2，張福艷1，2，王敏3，張煜行1，2*

（1.河北衡水老白干酒業(yè)股份有限公司，河北 衡水 053000；2.河北省白酒釀造工程技術(shù)研究中心，河北 衡水 053000；3.衡水學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 衡水 053000）

采用HS-SPME-GC-MS聯(lián)用的方法對(duì)衡水老白干酒的8個(gè)品種155個(gè)樣品進(jìn)行了指紋圖譜研究，數(shù)據(jù)采用單向多元方差分析的方法進(jìn)行處理。結(jié)果表明，建立了8個(gè)品種的共有指紋圖譜，不同品種之間可以很好的區(qū)分，同一酒精度的不同品種也能夠得到很好區(qū)分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠?qū)Υ驌舾叻录倬铺峁┛茖W(xué)依據(jù)。

衡水老白干酒；指紋圖譜；多元方差分析；頂空固相微萃取；氣質(zhì)聯(lián)用

衡水老白干酒具有悠久的歷史，以酒色清澈透明，醇香清雅，酒體諧調(diào)，柔和甘爽，回味悠長(zhǎng)而著稱(chēng)［1-2］，是中國(guó)白酒老白干香型的典型代表［3］。在競(jìng)爭(zhēng)日趨激烈的白酒市場(chǎng)，如何理性地評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量，在感官品評(píng)的基礎(chǔ)上，科學(xué)地表述產(chǎn)品的個(gè)性，這是白酒行業(yè)迫切需要解決的問(wèn)題。指紋圖譜可以對(duì)成分較復(fù)雜的樣品進(jìn)行全面反映，更加有效地體現(xiàn)產(chǎn)品的整體性。目前該技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用在葡萄酒、中藥、橄欖油、果汁、啤酒等行業(yè)中［4-8］，用于對(duì)原材料、半成品、成品進(jìn)行品質(zhì)分析、質(zhì)量監(jiān)控等方面。

白酒指紋圖譜的分析是借鑒于中藥指紋圖譜分析的成熟經(jīng)驗(yàn)［9-11］，大量的研究集中在不同香型的白酒或是不同地域的白酒［12-14］，或是同一廠家生產(chǎn)的白酒［15-17］，并取得了一定的科研成果。如潘鳳琴［12］采用頂空進(jìn)樣，結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析技術(shù)，建立了江西5個(gè)不同生產(chǎn)廠家的23個(gè)白酒樣品的指紋圖譜，并運(yùn)用系統(tǒng)聚類(lèi)分析及逐步判別分析對(duì)白酒的指紋圖譜進(jìn)行了模式識(shí)別研究，結(jié)果表明，不同廠家生產(chǎn)的白酒其GC-MS指紋圖譜既有較好的相關(guān)性，又存在一定差異，且系統(tǒng)聚類(lèi)分析及逐步判別分析均能對(duì)樣品進(jìn)行正確分類(lèi)，判別函數(shù)回判準(zhǔn)確率為100%，從而建立了識(shí)別不同廠家白酒的方法。孫其然等［16］對(duì)貴州茅臺(tái)酒的GC-MS指紋圖譜進(jìn)行了分析，建立了貴州茅臺(tái)酒模板指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)采用“夾角余弦法”的“指紋圖譜相似度計(jì)算軟件”能區(qū)分貴州茅臺(tái)酒和其他不同酒精度、不同香型的白酒，但對(duì)相同酒精度、同樣香型白酒的區(qū)分度明顯不夠，需要結(jié)合其特征峰的數(shù)量進(jìn)行綜合判斷。白酒受地域和氣候的影響非常大，因而不同地域不同香型的區(qū)分相對(duì)容易一些，對(duì)于同一生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的不同品種特別是相同酒精度的品種進(jìn)行良好區(qū)分的文獻(xiàn)未見(jiàn)報(bào)道。本文利用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用（headspace-solid phase microex-traction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）法得到的指紋圖譜，采用單因素方差分析的方法對(duì)8個(gè)品種的155個(gè)衡水老白干酒樣品進(jìn)行了分析，以期得到衡水老白干酒的共有指紋圖譜，區(qū)分不同品種和相同酒精度不同品種的衡水老白干酒。

1　材料與方法［2，18］

1.1材料與試劑

8個(gè)不同品種老白干成品酒（編號(hào)A-H，A品種23個(gè)樣品，B品種20個(gè)樣品，C品種17個(gè)樣品，D品種31個(gè)樣品，E品種13個(gè)樣品，F(xiàn)品種13個(gè)樣品，G品種26個(gè)樣品，H品種12個(gè)樣品，共計(jì)155個(gè)樣品，其中品種A和C酒精度相同，A-E取自南廠區(qū)，F(xiàn)-G取自北廠區(qū)）：衡水老白干酒業(yè)股份有限公司。

NaCl、乙酸正戊酯、無(wú)水乙醇（優(yōu)級(jí)純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

AgilentGC7890A-5975C&MSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent公司；50/30DVD/CVB/PMDS萃取頭（2 μm）：美國(guó)Supelco公司；CombiPAL進(jìn)樣器：瑞士CTC公司；IKA vortex3漩渦混合器：德國(guó)IKA公司；Eppendorf移液器：德國(guó)艾本德公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣品處理方法

內(nèi)標(biāo)液：準(zhǔn)確吸取2 mL乙酸正戊酯，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇定容至100 mL，配制成體積分?jǐn)?shù)2%的內(nèi)標(biāo)溶液；酒樣：樣品稀釋到10%vol，移取5.0 mL裝入20 mL頂空瓶，再加入2.5 g NaCl；酒樣溶液制備：吸取10 μL內(nèi)標(biāo)溶液于5 mL白酒中，在IKA vortex3渦旋混合器上混合1 min。

1.3.2微萃取法操作步驟

CTC萃取條件：50℃、250 r/min條件下孵化5 min，插入50/30DVD/CVB/PMDS萃取頭萃取6 min，然后在250℃條件下在進(jìn)樣口解吸6 min，以上操作由CTC進(jìn)樣器自動(dòng)操作運(yùn)行。

1.3.3GC-MS分析條件

氣相色譜條件：色譜柱CP-Wax57CB（50 m×0，25 mm× 0.2 μm）；柱溫40℃，以2℃/min升至100℃，然后以4℃/min升至200℃保持3 min，總運(yùn)行時(shí)間約58 min；載氣：高純氦氣（純度99.999%）；流速：1.2 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250℃；不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；接口溫度280℃；全掃描模式，掃描范圍29～450amu。

1.3.4定性定量方法

定性方法：以美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）11譜庫(kù)檢索為主，同時(shí)結(jié)合人工解析質(zhì)譜圖；計(jì)算分離出的揮發(fā)性成分的保留指數(shù)（retention index，RI），并與文獻(xiàn)值進(jìn)行對(duì)比。保留指數(shù)按照參考文獻(xiàn)的方法計(jì)算。

定量方法：內(nèi)標(biāo)法。

1.3.5指紋圖譜處理方法

采用ChemPatternTM化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件。

2　結(jié)果與分析

2.1方法學(xué)考察［18］

2.1.1儀器精密度實(shí)驗(yàn)

取同一批次白酒1份，按1.3方法制備樣品并連續(xù)進(jìn)樣5次，分別對(duì)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TIC圖中各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）＜0.10%，各色譜峰相對(duì)峰面積的RSD＜5%，表明儀器精密度良好。

2.1.2方法重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批次白酒1份，按1.3方法制備酒樣溶液并按實(shí)驗(yàn)條件測(cè)定，分別對(duì)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TIC圖中各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.1%，各色譜峰相對(duì)峰面積的RSD＜5%，表明該實(shí)驗(yàn)方法的重現(xiàn)性良好。

2.1.3樣品溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一批次白酒1份，按1.3方法制備酒樣溶液，并按實(shí)驗(yàn)條件分別在0、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣，對(duì)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積進(jìn)行測(cè)定，其中各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.15%，相對(duì)峰面積的RSD＜3.5%，表明酒樣在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.2單因素方差分析

樣品的積分參數(shù)：平滑窗口0，斜率55，最小峰寬0，最小峰高0，最小相對(duì)峰高0.01，最小峰面積0，最小相對(duì)峰面積0.05，通過(guò)上述參數(shù)的設(shè)置過(guò)濾掉極小的色譜峰，通過(guò)手動(dòng)的方法去除掉萃取頭和柱流失的色譜峰，通過(guò)保留時(shí)間校正（手動(dòng)+自動(dòng)）使各譜峰匹配。

2.3共有指紋圖譜的建立

圖1　衡水老白干揮發(fā)性成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograph of volatile components o Hengshui LaobaiganBaijiu

在chemmindTM軟件共有模式的生成參數(shù)：共有峰的來(lái)源（峰面積）；共有峰統(tǒng)計(jì)值（均數(shù)）；共有峰的篩選（25%，低四分位數(shù)）；最小共有峰值（0.1%）；譜圖模擬方法（平均色譜圖）；數(shù)據(jù)的預(yù)處理（均一化，觀測(cè)）。從而得到8個(gè)品種衡水老白干揮發(fā)性成分GC-MS總離子流色譜圖見(jiàn)圖1，分析鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，155個(gè)樣品的指紋圖譜中共有色譜峰為111個(gè)，這對(duì)于區(qū)分同一工廠及相同酒精度的白酒將具有重大意義。

表1　衡水老干白共有指紋圖譜色譜峰Table 1 Common fingerprint peaks in Hengshui LaobaiganBaijiu

2.4單向多元方差分析

155個(gè)樣品每個(gè)含有111個(gè)色譜峰信息，提供的數(shù)據(jù)是巨大的，常規(guī)的分析不能得出有益的結(jié)論，借助大數(shù)據(jù)處理軟件，可以得到很好的結(jié)果。在ChemPatternTM化學(xué)計(jì)量軟件中多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）在化學(xué)計(jì)量學(xué)中用于尋找分組間差異最大化的一組自變量的線性組合，自變量線性組合后形成的新變量稱(chēng)為典型變量（canonical variable，CV），主要用于尋找組間差異。利用該軟件對(duì)衡水老白干酒8個(gè)品種的155個(gè)樣品進(jìn)行單向多元方差分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2　衡水老白干酒8個(gè)品種的單向多元方差分析結(jié)果Fig.2 One-way multivariate analysis of variance results of eight types of Hengshui LaobaiganBaijiu

從圖2可以看出，8個(gè)品種的酒樣得到了一個(gè)良好的區(qū)分，同一酒精度的品種A和C也能夠很好區(qū)分。

3　結(jié)論

利用HS-SPME-GC-MS分析衡水老白干酒的不同品種，得到了衡水老白干酒的共有指紋圖譜，并對(duì)8個(gè)不同的品種有良好的區(qū)分，而且對(duì)于同一酒精度的兩個(gè)品種衡水老白干酒也能夠很好的區(qū)分。該方法對(duì)于質(zhì)量控制特別是打擊市場(chǎng)上高仿的衡水老白干酒具有支持作用。

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One-way multivariate analysis of variance on Hengshui LaobaiganBaijiufingerprint

JIANG Dongming1，2，LI Zexia1，2，ZHANG Fuyan1，2，WAN Min3，ZHANG Yuhang1，2*
（1.Hebei Hengshui Laobaigan Liquor-making（group）Co.，Ltd.，Hengshui 053000，China；2.Hebei Liquor-making Engineering Center，Hengshui 053000，China；3.College of Life Science，Hengshui University，Hengshui 053000，China）

Fingerprints of 155 samples of eight types of Hengshui LaobaiganBaijiuwere studied by HS-SPME-GC-MS，and then datas were treated with one-way multivariate variance analysis method.The results showed that a common fingerprint was established on eight types of theBaijiu，different types of theBaijiucan be distinguished well；and different types of theBaijiuwith same alcohol content can also be distinguished well.The experimental results can provide a scientific basis against fake Hengshui LaobaiganBaijiu.

Hengshui LaobaiganBaijiu；fingerprint；multivariate analysis of variance；HS-SPME；GC-MS

TS262.3；TS261.7

0254-5071（2016）09-0134-04doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.030

2016-04-22

姜東明（1970-），男，工程師，本科，主要從事白酒風(fēng)味化學(xué)的研究工作。

張煜行（1967-），男，高級(jí)工程師，碩士，主要從事白酒釀造工作。