海藻糖合成酶產生菌篩選、鑒定及其產酶特性

劉德海，權淑靜，解復紅，馬　煥，鞏　濤，賈　彬，陳國參

（1.河南省科學院 生物研究所有限責任公司，河南 鄭州 450008；2.河南省工業酶工程技術研究中心，河南 鄭州 450008）

海藻糖合成酶產生菌篩選、鑒定及其產酶特性

劉德海1，權淑靜2，解復紅2，馬煥2，鞏濤1，賈彬2，陳國參1

（1.河南省科學院 生物研究所有限責任公司，河南 鄭州 450008；2.河南省工業酶工程技術研究中心，河南 鄭州 450008）

以麥芽糖為唯一碳源高鹽培養基，經高溫培養，從溫泉水樣及其附近土壤中篩選得到一株菌株T2，經過生物合成途徑初步驗證，該菌株產海藻糖合酶，能夠通過海藻糖合成酶（TreS）途徑將麥芽糖轉化為海藻糖。菌株T2為革蘭氏陽性菌，桿狀，有芽孢，經過生物學鑒定，將其初步鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。對其產海藻糖合酶的酶學性質進行了研究：酶反應最適作用溫度為60℃，在60℃條件下保溫100 min仍能保持酶活性80.7%；最適作用pH值為7.0，在pH 6.0～7.5范圍內穩定。采用正交試驗對其發酵培養基配方進行了優化研究，確定了最佳的培養基組成為牛肉膏3.0 g/L，麥芽糖20.0 g/L，蛋白胨7.5 g/L，無機鹽（K2HPO4+NaH2PO4+MgSO4·7H2O）3.0 g/L。在此條件下，菌株T2產海藻糖合酶酶活力達到310.6 U/L。

海藻糖；海藻糖合酶；TreS途徑；篩選；鑒定

海藻糖（trehalose）是由2個葡萄糖分子以α-1，1糖苷鍵構成的非還原性糖，具有明顯的化學惰性和極強的穩定性［1］，是一種安全的功能性低聚糖［2］，具有非還原性、保濕性、熱酸穩定性、抗凍結、干燥性等多種生物學功能，而且其對生物體及生物大分有著非特異性良好的非特異性的保護作用［3］，在食品、醫學、輕工業領域中被廣泛應用［4］，特別是在食品工業中，作為食品添加劑能夠防止淀粉老化、防止蛋白質變性、防止脂類物質氧化變質、保持食品原有的色澤、風味、質地、營養等［5-6］，也可用于食品、水果、蔬菜的保鮮［7-8］，有很大的市場需求量［9］。

在不同生物中，海藻糖生物合成主要有三種途徑：（1）OtsA-OtsB途徑［10］，即以二磷酸尿核苷葡萄糖（Uridine diphosphate-glucose，UDPG）和6-磷酸葡萄糖為底物，通過6-磷酸海藻糖合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，TPS）和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶（trehalose-6-phosphatephosphate，TPP）兩種酶催化合成海藻糖；（2）TreY-TreZ途徑［11］，即以淀粉為底物，利用麥芽寡糖基海藻糖合成酶（maltooligosyl trehalose synthase，MTSase，TreY基因編碼）和麥芽寡糖基海藻糖水解酶（maltooligosyl trehalose hydrolase，MTHase，TreZ基因編碼）的協同作用，將淀粉轉化為海藻糖；（3）海藻糖合酶（trehalose synthase，TreS）途徑［12］，即以麥芽糖為底物，利用菌株內特異的海藻糖合成酶分子內轉糖基化作用，將麥芽糖轉化為α-1，1-糖苷鍵連接而成的海藻糖。

酶法轉化海藻糖一直是工業生產海藻糖的主要途徑，TreS途徑海藻糖合酶單酶轉化法生產海藻糖，可通過轉糖基作用直接將麥芽糖的α-1，4糖苷鍵轉化為α-1，1糖苷鍵生成海藻糖，反應流程短，非常容易調節和控制，是較為簡單的海藻糖生產方法，在工業酶法生產海藻糖中最具優勢，在工業化生產海藻糖中具有良好的應用前景［13-15］。

本研究采集河南魯山上湯溫泉水樣及其附近土壤，從中分離篩選得到一株產海藻糖的菌株T2，經過生物合成途徑初步驗證，該菌株含有海藻糖合酶以TreS途徑將麥芽糖轉化為海藻糖，并對該菌株發酵產海藻糖合酶酶學性質及其發酵培養基優化進行了初步研究，為其工業化發酵生產海藻糖提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料

河南魯山上湯溫泉水樣及其周圍土壤：采用多點隨機采樣法，取地下5 cm處土壤樣品混合，裝入無菌袋，風干，研磨過篩，放4℃冰箱中備用。

1.1.2主要試劑

2×ESTaqMasterMix（Dye）：北京康為世紀生物科技有限公司；16S rDNA基因的PCR擴增采用細菌提取擴增通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3，和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）：北京六合華大基因科技股份有限公司；E.Z.N.A.Bacterial DNA kit試劑盒（D3350-01）：美國Omega Bio-Tek公司；溶菌酶Lysozyme（20 000 U/mg）：北京索萊寶科技有限公司；瓊脂糖：法國Biowest公司；DNA Marker DL2000：北京康為世紀生物科技有限公司；海藻糖：美國Sigma公司；D-麥芽糖：北京奧博星生物技術有限責任公司；快速革蘭氏染色液：珠海貝索生物技術有限公司；糖化酶（100000U/g）：河南仰韶生化工程有限公司；3，5-二硝基水楊酸溶液（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）：國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為國產分析純。

10 mg/mL溶菌酶溶液：稱取溶菌酶1 g，超純水溶解定容于100 mL容量瓶中。

1.1.3培養基

菌種保藏培養基采用LB培養基：蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂15.0 g，水1 000 mL，pH 7.2。

富集培養基：蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化鈉10.0 g，水1 000 mL，pH 7.2。

菌種篩選培養基：麥芽糖20.0 g，蛋白胨5.0 g，牛肉膏2.0 g，K2HPO41.0 g，NaH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，NaCl 50.0 g，瓊脂15.0 g，水1 000 mL，pH 7.2。

產酶培養基：麥芽糖20.0 g，蛋白胨5.0 g，牛肉膏2.0 g，K2HPO41.0g，NaH2PO41.0g，MgSO4·7H2O1.0g，水1000mL，pH 7.2。

1.2儀器與設備

Nikon 50i熒光相差顯微鏡：日本Nikon公司；Multifuge X1R離心機：德國Thermo公司；ME204E電子天平、FE20實驗室pH計：瑞士Mettler Toledo公司；7146超純水機：美國Thermo公司；DNP-9052電熱恒溫培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；QYC-2012C恒溫搖床：上海福瑪實驗設備有限公司；T-Gradient Thermoblock PCR擴增儀：德國Biometra公司；DYY-6C電泳儀：北京六一儀器廠；T6新世紀紫外可見光分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；GF254硅膠板：青島海洋化工有限公司；薄層層析缸（10 cm×10 cm）：上海楚定分析儀器有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1菌株的篩選、分離純化

參照參考文獻［16］的方法。在無菌條件下用無菌藥勺取1.0g樣品加入富集培養基中，于37℃、160 r/min振蕩培養48 h。將富集后的菌液采用稀釋平板法進行稀釋，選擇適宜的稀釋度各吸取0.1 mL涂布于菌種篩選培養基平板上，45℃恒溫培養箱中培養48 h，每個稀釋度設三個重復，用無菌牙簽挑取色澤、外觀不同的單菌落交叉劃線法于菌種篩選培養基平板上，45℃恒溫培養箱中培養36 h進一步分離純化，挑取分離純化的單菌落轉接于菌種保藏培養基斜面試管上，37℃培養，待長出菌落后，進行記錄編號，放4℃冰箱中備用。

1.3.2粗酶液制備

將初篩出的單菌落試管斜面菌種挑取2～3環接種于60 mL發酵產酶培養基中，每250 mL三角瓶中裝入60 mL產酶培養基，37℃、160 r/min搖床振蕩培養48 h，離心機于4℃、6 000 r/min離心15 min，棄上清液，將獲得的菌體泥用50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.0）振蕩洗滌2～3次，收集濕菌體泥。

溶菌酶破壁：稱取1.0g濕菌體泥加入50 mmol/L磷酸緩沖液（pH7.0）定容至原發酵液體積制成菌懸液，加入800μL溶菌酶溶液，37℃振蕩破壁30 min，將破壁后的菌懸液于4℃、12 000 r/min離心15 min去沉淀，收集上清液即為粗酶液，用于酶活性定性定量分析。

1.3.3TreS途徑海藻糖合酶定性分析

取粗酶液加入同體積的10%麥芽糖溶液混合，37℃、160 r/min搖床振蕩培養15 h酶解試驗，沸水浴10 min滅酶終止反應，冷卻后于4℃、12 000 r/min離心15 min去沉淀，取上清液利用硅膠板GF254薄層層析法對上清液中的糖分進行定性分析，點樣量為1 μL。展開劑為正丁醇∶吡啶∶水=6∶4∶1（V/V），顯色劑為濃硫酸∶甲醇=20∶80（V/V）。

1.3.4海藻糖合酶TreS途徑的驗證

取粗酶液分別加入同體積的5%麥芽糖溶液、5%葡萄糖溶液、ddH2O混合，37℃、160 r/min搖床振蕩培養15 h酶解試驗，沸水浴10 min滅酶終止反應，冷卻后于4℃、12000r/min離心15min去沉淀，取上清液利用硅膠板GF254薄層層析法對上清液中的糖分進行定性分析驗證該菌株海藻糖合成途徑，點樣量為1 μL。

1.3.5TreS途徑海藻糖合酶定量分析

TreS途徑海藻糖合酶酶活性分析參考文獻［17］。取1mL粗酶液，與1 mL底物（10%麥芽糖溶液）混合后，在60℃水浴保溫1 h，沸水浴10 min滅酶終止反應，調pH4.6后加入1 mL的糖化酶液，60℃保溫1 h，沸水浴10 min滅酶活，12 000 r/min離心15 min，收集上清液，稀釋定容后，取稀釋液1 mL與2 mL DNS，沸水浴10 min，冷卻后于波長540 nm處比色。空白對照：1 mL底物（10%麥芽糖溶液）在60℃水浴保溫1 h后，補加入1 mL粗酶液混勻，沸水浴10 min滅酶終止反應，其他操作同上。

海藻糖合酶酶活力定義：在60℃、pH7.0反應條件下，以10%麥芽糖為底物，每1 h產生1 mg海藻糖為1個酶活力單位（U/L）。

1.3.6菌株的鑒定［18-20］

形態學觀察及生理生化特征分析：將篩選出的菌株接種到LB培養基平板上培養，觀察其菌落生長特征：形狀大小、邊緣、隆起形狀、透明度、色澤等，并作記錄；革蘭氏染色后，顯微鏡進行觀察。

分子生物學鑒定：16S rDNA的擴增及測序，細菌DNA的提取按試劑盒說明書操作流程提取。PCR擴增采用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。

PCR擴增體系25μL：上游引物1.0μL，下游引物1.0μL，2×EsTaqMasterMix（Dye）12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，提取模板DNA 1.0 μL。

PCR反應條件：95℃預變性10 min，94℃變性1 min，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，30個循環。

PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析檢測驗證后，序列測定送北京六合華大基因科技股份有限公司完成。將測序結果序列提交Genbank數據庫進行BLAST同源性序列比對相似性分析，并用MEGA 6.0軟件構建16S rDNA基因的系統發育樹。

1.3.7菌株產海藻糖合酶酶學性質研究

粗酶液12 000 r/min離心15 min去沉淀，上清液經60%（NH4）2SO4沉淀，透析脫鹽后進行進行酶學性質的研究。

最適反應溫度：將酶液分別在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃條件下，與底物10%麥芽糖進行酶促反應，酶轉化結束后測定海藻糖合酶相對酶活力（均以同組中最高酶活力為100%），確定該菌株產海藻糖合酶最適反應溫度。

熱穩定性：將酶液分別在60℃保溫0、20 min、40 min、60 min、80 min、100 min后，測定剩余海藻糖合酶相對酶活力，考察該菌株產海藻糖合酶的熱穩定性。

最適作用pH：將酶液分別置于pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0緩沖溶液中，測定海藻糖合酶相對酶活力，確定該菌株產海藻糖合酶最適作用pH。

pH穩定性：將酶液分別與pH值為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0緩沖溶液混合，于60℃保溫30 min，測定相對酶活力，考察酶在不同pH條件下的穩定性。

1.3.8培養基優化正交試驗

根據初始發酵培養基設計產酶發酵培養基優化正交試驗。選擇麥芽糖、蛋白胨、牛肉膏、無機鹽（K2HPO4+ NaH2PO4+MgSO4·7H2O，質量比為1∶1∶1）為4種因素，每個因素設計3個水平，設計正交試驗，培養基裝液量60mL/250mL，37℃、160 r/min搖床振蕩培養48 h，分析優化出菌株較佳的培養基配方。正交試驗因素與水平見表1。

表1　發酵培養基配方優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation medium formula optimization　g/L

2　結果與分析

2.1菌株的分離、篩選及產酶試驗

通過富集培養、稀釋平板法，經過45℃恒溫培養的菌種篩選培養基平板上分離，交叉劃線法進一步純化篩選出17株菌株，將17株菌株分別接種于產酶培養基搖床發酵培養，發酵培養液高速離心收集菌體，振蕩洗滌，溶菌酶破壁，離心獲得粗酶液，粗酶液于麥芽糖酶解反應液，離心上清酶反應液利用硅膠板GF254薄層層析法對菌株酶反應液中的糖份進行定性分析，發現有4株菌株產生海藻糖痕跡，分別編號為T1、T2、T3、T4，由4株菌株的薄層層析結果可知，4株菌株的酶反應液中均含有海藻糖和麥芽糖，均能夠產生海藻糖，菌株細胞內產海藻糖合酶。對其進行定量分析，結果見表2。

表2　菌株產海藻糖合酶定量分析結果Table 2 Quantitative analysis results of strains producing trehalose synthase

由表2可知，菌株T2檢測出的海藻糖合酶酶活性較其他3株菌株的高，達到了120.0 U/g。故選擇菌株T2為進行下一步研究的出發菌株，對其代謝途徑、生物學特征及發酵產酶特性進行了研究。

2.2菌株T2海藻糖合酶TreS途徑的驗證

取菌株T2發酵產粗酶液分別加入同體積的5%麥芽糖溶液、5%葡萄糖溶液、ddH2O混合進行酶解試驗，利用硅膠板GF254薄層層析法對菌株酶反應液中的糖份進行定性分析，結果表明，在以5%葡萄糖溶液、ddH2O為底物的酶解反應體系中，在硅膠板GF254薄層層析中均沒有發現海藻糖的存在，在以5%麥芽糖溶液為底物的酶解反應體系中有海藻糖的生成，可以初步確定菌株T2以麥芽糖為底物合成海藻糖的途徑是通過海藻糖合酶TreS途徑酶解完成的。

2.3菌株T2的生物學鑒定

2.3.1菌株T2的形態特征

菌株T2接種到LB培養基平板上，37℃恒溫培養箱中培養24 h后，菌落形狀不規則，直徑2～3 mm，白色，凸起，不透明，黏稠有光澤，易于挑起，革蘭氏染色為陽性，有芽孢產生，顯微觀察結果見圖1。由圖1可知，菌體呈桿狀，長2.0～5.0 μm，寬0.8～1.1 μm。

圖1　菌株T2顯微照片（×1000）Fig.1 Photomicrograph of strain T2（×1000）

2.3.2菌株T2生理生化特征

菌株T2生理生化特征見表3。

表3　菌株T2生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain T2

由表3可知，根據菌株的生理生化特征，可以初步判斷該菌株T2為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

2.3.3菌株T2分子生物學特征

以提取的菌株T2的DNA為模板，采用細菌提取擴增通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3進行PCR擴增，菌株T2的16S rDNA的PCR擴增結果見圖2。

圖2　PCR擴增的16S rDNA電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR amplified 16S rDNA of strain T2

從圖2可以看出，經PCR擴增后，根據與北京康為世紀生物科技有限公司DNA Marker DL2000對照，得到了一個片段長度為1 409 bp的DNA片段。將測序結果基因序列提交到GenBank核酸序列數據庫中與已有的相關同源序列BLAST比對分析。并在16S rDNA基因序列同源性基礎上構建系統發育樹，菌株T2的系統發育樹見圖3。

圖3　菌株T2的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain T2

通過以上對菌株T2的形態特征、主要生理生化特征、16S rDNA的基因序列分析及系統發育樹分析，16S rDNA基因于菌株Bacillus aerophilus28K（T）相似性達到100%，可以初步認定該菌株T2為芽孢桿菌屬的嗜氣桿菌（Bacillus aerophilus）。

2.4菌株T2產海藻糖合酶酶學性質研究

2.4.1最適作用溫度

圖4　溫度對酶活力的影響Fig.4 Effect of temperature on trehalose synthase activity

由圖4可知，菌株T2產海藻糖合酶最適作用溫度為60℃。

2.4.2海藻糖合酶的熱穩定性

圖5　酶的熱穩定性Fig.5 Thermal stability of trehalose synthase

由圖5可知，60℃條件下，菌株T2產海藻糖合酶保溫100 min剩余酶活性80.7%，說明酶熱穩定性良好。

2.4.3最適作用pH

圖6　pH值對酶活力的影響Fig.6 Effect of pH on trehalose synthase activity

由圖6可知，pH值為7時，菌株T2產海藻糖合酶酶活力達到最大值，因此，菌株T2產海藻合酶的最適pH值為7。

2.4.4pH穩定性

圖7　酶的pH穩定性Fig.7 pH stability trehalose synthase

由圖7可知，菌株T2產海藻糖合酶在pH 6.0～7.5范圍內保溫30 min，剩余酶活力均＞63%，說明酶活在pH 6.0～7.5范圍較為穩定。

2.5菌株T2產海藻糖合酶培養基優化試驗

表4　發酵培養基配方優化正交試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation medium formula optimization

由表4可知，對菌株T2產海藻糖合酶發酵培養基中的影響因素為C＞A＞B＞D。其適宜的培養基配方為C3A2B3D2，即牛肉膏3.0 g/L，麥芽糖20.0 g/L，蛋白胨7.5 g/L，無機鹽（K2HPO4+NaH2PO4+MgSO4·7H2O）3.0 g/L。在此優化的培養基下，菌株T2細胞內產海藻糖合酶酶活力達到310.6 U/L。

3　結論

本研究從河南魯山上湯溫泉水樣及其附近土壤中，經篩選培養基高溫高鹽培養，分離篩選得到一株產海藻糖的菌株T2，通過對菌株T2的形態特征、主要生理生化特征、16SrDNA的基因序列分析及系統發育樹分析，初步認定該菌株T2為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。經過生物合成途徑初步驗證，該菌株含有海藻糖合酶以TreS途徑將麥芽糖轉化為海藻糖。對該菌株發酵產海藻糖合酶酶學性質就行了研究，其最適作用溫度為60℃，在60℃條件下，菌株T2產海藻糖合酶保溫100 min仍能保持酶活性80.7%；pH 7.0時，菌株T2產海藻糖合酶酶活力達到最大值，在pH 6.0～7.5范圍內保溫30 min，剩余酶活力在63%以上。對該菌株發酵產海藻糖合酶培養基進行了優化研究，其適宜的培養基配方為C3A2B3D2，即牛肉膏3.0 g/L，麥芽糖20.0 g/L，蛋白胨7.5g/L，無機鹽（K2HPO4+NaH2PO4+MgSO4·7H2O）3.0 g/L。在此優化的培養基下，菌株T2產海藻糖合酶酶活力達到310.6 U/L。

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Screening and identification of a trehalose-producing strain and its enzyme-producing characteristics

LIU Dehai1，QUAN Shujing2，XIE Fuhong2，MA Huan2，GONG Tao1，JIA Bin2，CHEN Guocan1
（1.Institute of Biology Co.，Ltd.，Henan Academy of Science，Zhengzhou 450008，China；2.Henan Engineering Research Center of Industrial Enzymes，Zhengzhou 450008，China）

Through the method of high NaCl concentration cultivation with maltose as single carbon source，a strain T2 producing trehalose synthase was screened from hot springs water and nearby soil.By primarily biosynthetic validation，the results showed that strain T2 produced trehalose synthase，and it could convert maltose into trehalose by trehalose synthase（TreS）path.The cells were gram-positive，rods，endospores，and strain T2 was primary identified asBacillussp.by biological identification.The enzymatic characteristics of trehalose synthase were studied，it showed that the optimum reaction temperature and pH were 60℃and 7.0，respectively.After incubation at 60℃for 100 min，it remained 80.7%of its activity.The enzyme was stable in the range of pH 6.0-7.5.Compositions of medium was optimized by L9（34）orthogonal experiments，and the optimum medium compositions were beef extract 3.0 g/L，maltose 20.0 g/L，peptone 7.5 g/L，inorganic salt（K2HPO4+NaH2PO4+MgSO4·7H2O）3.0 g/L.The trehalose synthase activity of the strain T2 was up to 310.6 U/L under the optimized conditions.

trehalose；trehalose synthase；trehalose synthase path；screen；identification

TQ920.1

0254-5071（2016）09-0095-06doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.022

2016-06-08

2015年河南省科技創新杰出人才項目（154200510025）

劉德海（1970-），男，研究員，本科，主要從事酶工程研究工作。