馬鈴薯淀粉水解條件優(yōu)化及油脂酵母培養(yǎng)研究

鐘　琦，吳慧昊，代軍飛，牛　鋒*

（1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 實驗中心，甘肅 蘭州 730124）

馬鈴薯淀粉水解條件優(yōu)化及油脂酵母培養(yǎng)研究

鐘琦1，吳慧昊2，代軍飛1，牛鋒1*

（1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 實驗中心，甘肅 蘭州 730124）

以馬鈴薯淀粉為底物，葡萄糖含量為評價指標，通過響應(yīng)面法優(yōu)化淀粉酶解工藝，將水解液用于發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂。最佳酶解條件為馬鈴薯淀粉質(zhì)量濃度20 mg/mL，加酶量為干淀粉質(zhì)量3.2%，α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶的質(zhì)量比2.2∶1，pH 4.1，酶解時間4.1 h，得到最高葡萄糖含量為15.06 mg/mL。向此水解液中添加一定氮源和無機鹽用于油脂酵母菌株Y004-2培養(yǎng)，在250 mL三角瓶中其生物量為14.43 g/L，油脂產(chǎn)量5.16 g/L，在5.0 L發(fā)酵罐中生物量為14.27 g/L，油脂產(chǎn)量5.10 g/L，其生物量和油脂產(chǎn)量均略高于以葡萄糖為碳源；且菌株Y004-2在以馬鈴薯淀粉水解液為碳源的培養(yǎng)基中所得油脂的組成與以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中所得油脂的脂肪酸組成相同。

馬鈴薯淀粉；葡萄糖；微生物油脂

馬鈴薯（Solanum tuberosum）又名土豆、洋芋、山藥蛋等，是世界上僅次于小麥、水稻和玉米后的第四大糧食作物，也是繼小麥和玉米之后的第三大淀粉原料［1-2］。馬鈴薯不僅兼有糧食、蔬菜和飼料等功能，而且還是潛在的生物質(zhì)能源作物，具有極大的發(fā)展?jié)摿Γ?］。近年來，中國馬鈴薯產(chǎn)業(yè)在甘肅、寧夏、內(nèi)蒙古等省區(qū)已經(jīng)形成產(chǎn)業(yè)化的生產(chǎn)基地，使得中國馬鈴薯淀粉產(chǎn)量居世界前列［4］。以馬鈴薯淀粉水解液為碳源培養(yǎng)油脂微生物，為馬鈴薯淀粉及其廢棄液進行大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)微生物油脂提供參考。

微生物油脂具有很多生理生化功能，如γ-亞麻酸（γ-linolenic acid，GLA）具有抗高血壓和抗粥樣動脈硬化功能［5］；花生四烯酸（arachidonic acid，ARA）能預(yù)防心血管疾病和腫瘤發(fā)生［6］；二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）能夠促進二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid， DHA）在大腦中的積累，還能增加血管的通透性［7］；DHA具有健腦明目、延緩衰老的作用［8］。同時，微生物油脂還可以作為生物柴油的理想原料［9］。

利用微生物發(fā)酵農(nóng)副產(chǎn)品，將其轉(zhuǎn)化為微生物油脂的研究已經(jīng)成為當今科學(xué)技術(shù)研究的熱點之一。從資源化利用角度考慮，馬鈴薯淀粉經(jīng)過酶解得到葡萄糖、麥芽糖、低聚糖等［10］，再在水解液中添加一定量的氮源、無機鹽和生長因子等，用以培養(yǎng)油脂微生物，不僅能夠省去工業(yè)生產(chǎn)葡萄糖的繁瑣過程，縮短運輸時間，降低生產(chǎn)成本，還可以節(jié)約大量工業(yè)用水，是一種提高生物質(zhì)能源和降低生產(chǎn)成本的理想途徑。為了簡化操作步驟、降低高溫耗能和縮短水解時間，本研究采用α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶協(xié)同水解馬鈴薯淀粉，并考察馬鈴薯淀粉水解液替代葡萄糖培養(yǎng)油脂酵母對其生物量和油脂積累的影響，以期為降低微生物油脂的生產(chǎn)成本提供一定理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種與試劑

粘性絲孢酵母（Trichosporon mucoides）Y004-2：實驗室保存。

馬鈴薯淀粉：甘肅臨洮縣華茂淀粉廠；α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶：邢臺萬達生物工程有限公司；酵母膏、蛋白胨：杭州微生物試劑有限公司；磷酸二氫鉀、苯酚、硫酸鎂（分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；亞硫酸鈉、酒石酸鉀鈉（分析純）：天津市元立化工有限公司；氫氧化鉀（優(yōu)級純）：上海中秦化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純）：安徽時聯(lián)特種溶劑股份有限公司；乙醚（分析純）：上海譜振生物科技有限公司；正己烷（色譜純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；脂肪酸甲酯標準品（純度≥99.99%）：美國Sigma公司。

1.1.2培養(yǎng)基

麥氏培養(yǎng)基：葡萄糖1 g/L，酵母浸膏2.5 g/L，醋酸鈉8 g/L，氯化鉀1.8 g/L，pH自然。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母浸膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，pH自然。

發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基：葡萄糖80 g/L，酵母浸膏5 g/L，蛋白胨2 g/L，磷酸二氫鉀5 g/L，硫酸鎂1 g/L，pH自然。

1.2儀器與設(shè)備BX51T-32P01數(shù)碼光學(xué)顯微鏡：日本Olympus儀器有限公司；LDZX-50FAS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；Neofuge 23R高速冷凍離心機：上海力申科學(xué)儀器有限公司；Genesys 10A UV-UIS紫外分光光度計：賽默飛世爾科技公司；BIOF-6000B 5L發(fā)酵罐：上海理工大學(xué)高機有限責任公司；6890N型氣相色譜儀：美國安捷倫公司。

1.3實驗方法

1.3.1葡萄糖含量的測定根據(jù)參考文獻［11］，繪制葡萄糖標準曲線，采用3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測定馬鈴薯淀粉水解液中的葡萄糖含量。

1.3.2協(xié)同酶解馬鈴薯淀粉工藝試驗［12］

稱取30 g馬鈴薯淀粉溶于150 mL蒸餾水，于60℃恒溫水浴鍋中糊化30 min，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH，并加入CaCl2，使水解液中Ca2+質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL。搖勻后，加入α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶，在80℃進行酶解。反應(yīng)結(jié)束后，于120℃保溫20 min使酶失活，結(jié)束酶解過程。采用DNS法測定水解液中葡萄糖含量。

1.3.3馬鈴薯淀粉水解液和葡萄糖分別作為發(fā)酵碳源對產(chǎn)脂發(fā)酵的影響

配制20 mg/mL馬鈴薯淀粉溶液，按協(xié)同酶解馬鈴薯淀粉的最佳水解條件進行酶解。結(jié)束酶解過程，采用DNS法測定葡萄糖含量，濃縮酶解液，調(diào)節(jié)葡萄糖質(zhì)量濃度為80 g/L。在250 mL三角瓶（裝液量70 mL/250 mL）和5.0 L發(fā)酵罐（裝液量1.5 L/5 L）中分別配制以馬鈴薯淀粉水解液和葡萄糖為碳源的80 g/L的發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基。

將菌株Y004-2在麥氏培養(yǎng)基活化后接種到種子培養(yǎng)基中，再以5%接種量分別接種至兩種不同碳源的發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基上，120r/min、30℃的條件下培養(yǎng)144h。考察不同發(fā)酵碳源對菌株Y004-2的生長和油脂積累的影響。

1.3.4生物量的測定

生物量的測定采用干質(zhì)量法［13］。

1.3.5油脂提取及脂肪酸成分分析

采用索氏抽提法提取菌體內(nèi)的油脂［14］。參照文獻［15］的方法，油脂進行堿法甲酯化后進氣相色譜分析，色譜條件：Inert Cap FFAP毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.50 μm）；升溫程序：初始溫度100℃，保持5 min，然后以50℃/min升至150℃保持3 min，再4℃/min升至230℃保持40 min。進樣口溫度250℃，檢測器溫度270℃，載氣為氮氣（≥99.999%），進樣量1 μL［16］。

2　結(jié)果與分析

2.1葡萄糖標準曲線的測定

根據(jù)葡萄糖標準品系列濃度在波長540nm處的吸光度值，得到標準曲線回歸方程：y=0.9938x-0.0292（R2=0.996），表明葡萄糖質(zhì)量濃度在0～1 g/L的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2馬鈴薯淀粉酶解條件的優(yōu)化單因素試驗

2.2.1加酶量對協(xié)同酶解的影響

加酶量對馬鈴薯淀粉酶解的影響結(jié)果見圖1。由圖1可知，馬鈴薯淀粉水解液中葡萄糖含量隨著加酶量的增加呈增加趨勢。當加酶量＜2.4%，葡萄糖含量隨著加酶量的增加而顯著增加（P＜0.05），而當加酶量＞2.4%，加酶量對葡萄糖含量的影響則不顯著（P＞0.05），因此，從節(jié)約成本方面考慮，選擇干淀粉質(zhì)量的2.4%作為最佳加酶量。

圖1　加酶量對淀粉酶解的影響Fig.1 Effect of enzyme addition on starch enzymolysis

2.2.2α-淀粉酶與葡萄糖淀粉酶的質(zhì)量比對協(xié)同酶解的影響

α-淀粉酶與葡萄糖淀粉酶的質(zhì)量比對馬鈴薯淀粉酶解的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著α-淀粉酶與葡萄糖淀粉酶的質(zhì)量比逐漸增加，葡萄糖含量呈先上升后下降趨勢。隨著α-淀粉酶與葡萄糖淀粉酶的質(zhì)量比的增加，其葡萄糖含量顯著逐漸增加（P＜0.05），但質(zhì)量比超過3∶1后，其葡萄糖含量顯著下降。可能原因是α-淀粉酶含量過大，會使馬鈴薯淀粉在液化過程中生成的底物分子過高，會抑制糖化反應(yīng)的水解作用，降低淀粉水解率［17］。故選擇α-淀粉酶與葡萄糖淀粉酶的質(zhì)量比為2∶1。

圖2　α-淀粉酶與葡萄糖淀粉酶添加比例對淀粉酶解的影響Fig.2 Effect of α-amylase and glucoamylase ratio on starch enzymolysis

2.2.3初始pH值對協(xié)同酶解的影響

初始pH值對馬鈴薯淀粉酶解的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著pH值增加，葡萄糖含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。馬鈴薯淀粉水解液的初始pH值為4.0時，經(jīng)過水解后，其葡萄糖含量顯著高于其他處理組（P＜0.05）；水解液初始pH值為5.0時，葡萄糖含量顯著低于其他處理組。因此，選擇初始pH值為4.0的馬鈴薯淀粉水解液進行酶解。

圖3　pH對淀粉酶解的影響Fig.3 Effect of pH on starch enzymolysis

2.2.4酶解時間對協(xié)同酶解的影響

酶解時間對馬鈴薯淀粉酶解的影響見圖4。馬鈴薯淀粉水解液中葡萄糖含量隨著酶解時間的增加呈逐漸增加的趨勢。隨著酶解時間的增加，馬鈴薯淀粉水解液中葡萄糖含量顯著增加（P＜0.05），但超過4.0 h后，葡萄糖含量不再隨著時間的增加而顯著增加，為減少能耗，節(jié)約時間，以4.0 h作為最佳的酶解時間。

圖4　酶解時間對淀粉酶解的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on starch enzymolysis

2.3馬鈴薯淀粉酶解條件的優(yōu)化——響應(yīng)面試驗

2.3.1響應(yīng)面試驗方案設(shè)計及結(jié)果分析

在加酶量一定，底物質(zhì)量濃度為20 mg/mL的條件下，以A（α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶質(zhì)量比）、B（初始pH值）、C（酶解時間）為自變量，葡萄糖含量（Y，mg/mL）為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面分析試驗。每組試驗設(shè)置3個重復(fù)，取平均值，結(jié)果見表1。

表1　響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析Table 1 Results and analysis of response surface methodology

通過對試驗結(jié)果進行響應(yīng)面分析，經(jīng)二次回歸擬合，得到3個因素與葡萄糖含量之間的模擬方程為：Y=15.03+ 0.66A+0.35B+0.46C+0.037AB+0.24AC-0.16BC-1.59A2-1.57B2-1.86C2。對3個自變量模型的方差分析見表2。

表2　響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析Table 2 Variance analysis of response surface methodology results

由表2方差分析可知，A、B、C、A2、B2和C2呈現(xiàn)極顯著影響（P＜0.01），AB呈現(xiàn)顯著影響（P＜0.05），AC和BC影響不顯著。F檢驗為極顯著（P＜0.01），失擬項α=0.05水平不顯著，說明該擬合方程與實際情況相符合，具有實際應(yīng)用意義；該模型的決定系數(shù)R2為0.986 2，調(diào)整后的決定系數(shù)為0.968 4，變異系數(shù)為2.42%，確認該模型可信，可以用于分析和預(yù)測馬鈴薯淀粉水解液中葡萄糖的含量。

2.3.2響應(yīng)面試優(yōu)化結(jié)果及驗證

根據(jù)響應(yīng)面分析得到α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶協(xié)同水解淀粉的最佳工藝參數(shù)為：馬鈴薯淀粉質(zhì)量濃度為20mg/mL，α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶質(zhì)量比為2.23∶1，初始pH 4.06，酶解時間為4.13 h，預(yù)測葡萄糖含量為15.16 mg/mL。為實際操作方便，將工藝優(yōu)化為α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶的質(zhì)量比2.2∶1，初始pH4.1，酶解時間4.1h。采用上述最佳工藝參數(shù)驗證響應(yīng)面分析的可靠性。經(jīng)過3次平行試驗，葡萄糖含量為15.06 mg/mL，與理論值基本吻合，說明該模型合理有效，可以較好地對試驗結(jié)果進行預(yù)測。

2.4以葡萄糖和馬鈴薯淀粉水解液分別作為碳源對發(fā)酵產(chǎn)脂的影響

為進一步考察菌株Y004-2在以馬鈴薯淀粉水解液作為碳源的條件下對發(fā)酵產(chǎn)脂特性的影響，在相同碳源濃度下，分別以葡萄糖和馬鈴薯淀粉水解液為發(fā)酵碳源，對Y004-2的生長和油脂積累情況進行比較。

2.4.1對菌株形態(tài)的影響

在10×100油鏡下分別觀察菌株Y004-2的簡單染色涂片，分別在以葡萄糖和馬鈴薯淀粉水解液為發(fā)酵碳源的培養(yǎng)基中30℃、120 r/min條件下培養(yǎng)144 h，菌絲體形態(tài)見圖5。由圖5可知，在葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中，菌株Y004-2具有典型的橢球形菌體和假絲狀菌絲；以馬鈴薯淀粉水解液為發(fā)酵碳源的培養(yǎng)基中，菌株Y004-2同樣具有典型的橢球形菌體和假絲狀菌絲，菌絲大小基本相同，且部分橢球形菌體都以出芽形式進行無性繁殖。說明菌株Y004-2可以在以馬鈴薯淀粉水解液為碳源的培養(yǎng)基中正常生長和繁殖。

圖5　菌株Y004-2在以葡萄糖（A）及馬鈴薯淀粉水解液（B）為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的的菌體形態(tài)Fig.5 Mycelia morphology of strain Y004-2 on medium using glucose（A）and potato starch hydrolysis（B）as carbon source

2.4.2不同碳源對發(fā)酵產(chǎn)脂的影響

表3　不同碳源對發(fā)酵產(chǎn)脂的影響Table 3 Effect of carbon sources on fermentaion for oil production

不同碳源對發(fā)酵產(chǎn)脂的試驗結(jié)果見表3。由表3可知，菌株Y004-2分別在以馬鈴薯淀粉水解液和葡萄糖為碳源的發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)144 h后，在250 mL三角瓶中，其生物量和油脂含量分別為14.43 g/L和5.16 g/L，在以葡萄糖為碳源的發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基中，其生物量和油脂含量分別為14.15 g/L和4.99 g/L；在5.0 L發(fā)酵罐中，菌株Y004-2以馬鈴薯淀粉水解液為碳源的培養(yǎng)基中所得的生物量和油脂含量分別為14.27g/L和5.10g/L；以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中，其生物量和油脂含量分別為13.81 g/L和4.80 g/L。結(jié)果表明：與以葡萄糖為碳源的發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基相比，在馬鈴薯淀粉水解液為碳源的發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基中，菌株Y004-2的生物量和油脂產(chǎn)量都略高于以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基，其可能原因是馬鈴薯淀粉水解液中含有某些營養(yǎng)物質(zhì)能夠促進菌株Y004-2的生長和油脂積累。在250 mL的三角瓶中培養(yǎng)菌株Y004-2的生物量和油脂產(chǎn)量也略高于5.0 L發(fā)酵罐，可能原因是由于發(fā)酵罐的攪拌軸對酵母細胞產(chǎn)生一定的剪切力，從而影響對菌株Y004-2的生長和油脂的積累。

2.4.3對脂肪酸成分的影響

脂肪酸的氣相色譜分析結(jié)果見圖6。由圖6表明，菌株Y004-2在以馬鈴薯淀粉水解液為碳源的培養(yǎng)基中所產(chǎn)油脂的脂肪酸組成與以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中所產(chǎn)油脂的脂肪酸組成相同，油脂組成均為十六碳和十八碳，主要為棕櫚酸甲酯（C16∶0）、亞油酸甲酯（C18∶2）、γ-亞麻酸甲酯（C18∶3）和反油酸甲酯（C18∶3），說明菌株Y004-2可以在以馬鈴薯淀粉水解液為碳源的發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基中正常生長并積累微油脂。

3　結(jié)論

本文將響應(yīng)面法應(yīng)用于α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶協(xié)同水解馬鈴薯淀粉。回歸分析和驗證試驗結(jié)果表明，利用α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶協(xié)同水解淀粉的方法合理可行。最佳水解條件為：馬鈴薯淀粉質(zhì)量濃度20 mg/mL，加酶量2.4%，α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶的質(zhì)量比2.2∶1，初始pH 4.1和酶解時間4.1h，在此條件下，葡萄糖含量為15.06mg/mL。

在以馬鈴薯淀粉水解液為碳源的發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株Y004-2，其菌株形態(tài)和大小基本一致，都具有典型的橢球形菌體和假絲狀菌絲。在250 mL搖瓶中利用以馬鈴薯淀粉水解液為碳源的發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基培養(yǎng)Y004-2，生物量為14.43 g/L，油脂產(chǎn)量為5.16 g/L；在5.0 L發(fā)酵罐中，生物量為14.27 g/L、油脂產(chǎn)量為5.10 g/L。同時，氣相色譜結(jié)果表明兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株Y004-2所產(chǎn)油脂的脂肪酸組成成分基本相同，主要為棕櫚酸甲酯、亞油酸甲酯、γ-亞麻酸甲酯和反油酸甲酯。由此說明菌株Y004-2可以在以馬鈴薯淀粉水解液為碳源的發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基中正常生長并積累微油脂。

利用α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶協(xié)同水解馬鈴薯淀粉作為碳源培養(yǎng)油脂微生物，對實現(xiàn)生物質(zhì)資源化利用及降低微生物油脂生產(chǎn)成本具有重要意義，有助于解決微生物油脂工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)和微生物油脂生產(chǎn)原料問題，為微生物油脂工業(yè)化發(fā)展提供了一定參考。

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Optimization of potato starch hydrolysis conditions and cultivation of oleaginous yeast

ZHONG Qi1，WU Huihao2，DAI Junfei1，NIU Feng1*
（1.College of Life Sciences and Engineering，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730030，China；2.Science Experiment Center，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730124，China）

Using potato starch as substance，glucose yield as evaluation index，the optimum hydrolysis conditions was optimized by response surface methodology，and then the hydrolysate was used for microbial oil production.The results showed that the optimum hydrolysis condition was starch concentration 20 mg/ml，enzyme addition 3.2%of dry starch，α-amylase to glucamylase mass ratio 2.2∶1，pH 4.1，and hydrolysis time 4.1 h.Under the condition，the glucose content reached 15.06 mg/ml.Nitrogen source and inorganic salt was added in the hydrolysate to culture oleaginous yeast Y004-2，the biomass was 14.43 g/L，oil production was 5.16 g/L in 250 ml flask.While the biomass was 14.27 g/L，oil production was 5.10 g/L in 5.0 L fermenter.The oil composition of strain Y004-2 in the medium of potato starch hydrolysate as carbon source was same with glucose as carbon source.

potato starch；glucose；microbial oil

Q93

0254-5071（2016）09-0090-05doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.021

2016-03-31

2014年國家民委科研項目（14XB2015）；2015年西北民族大學(xué)實驗室開放項目；2016年西北民族大學(xué)實驗室開放項目；西北民族大學(xué)研究生科研（實踐）創(chuàng)新項目（Ymx2014180）

鐘琦（1990-），女，碩士研究生，研究方向為油脂微生物。

牛鋒（1960-），男，教授，碩士，研究方向為油脂微生物。