酶-超聲輔助提取苦蕎稈中總黃酮及抗氧化活性研究

楊海濤，曹小燕*

（1.陜西理工大學(xué) 陜西省催化基礎(chǔ)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 漢中 723000；2.陜西理工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中 723000）

酶-超聲輔助提取苦蕎稈中總黃酮及抗氧化活性研究

楊海濤，曹小燕*

（1.陜西理工大學(xué) 陜西省催化基礎(chǔ)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 漢中 723000；2.陜西理工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中 723000）

以秦巴山區(qū)苦蕎稈為原料，通過單因素結(jié)合正交試驗(yàn)研究了纖維素酶-超聲輔助提取苦蕎稈中總黃酮的工藝條件，并考察其對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基和ABTS自由基正離子的清除活性及還原能力。結(jié)果表明，苦蕎桿總黃酮的最佳提取工藝為：纖維素酶10 mg/g，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，超聲溫度40℃，超聲時(shí)間30 min，料液比為1∶40（g∶mL），該條件下總黃酮的得率為2.30%，苦蕎稈總黃酮對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基和ABTS自由基正離子的半抑制濃度IC50值分別為0.18 mg/mL、0.24 mg/mL和2.24 μg/mL，強(qiáng)于同濃度條件下天然抗氧化劑維生素C。

苦蕎稈；黃酮；纖維素酶；超聲提取；抗氧化活性

苦蕎屬雙子葉蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum）植物，又名春蕎、野蕎麥，學(xué)名韃靼蕎麥（F.tataricum），原產(chǎn)于我國東北和西南部四川涼山地區(qū)［1］，是自然界中較少的藥食兩用作物［2］。大量研究表明苦蕎具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，其中維生素B2的含量是大米和小麥的3～11倍，蛋白質(zhì)、脂肪和鉀、鎂、鐵等礦物元素含量均明顯高于大米和小麥。苦蕎富含蘆丁、葉綠素、槲皮素、桑色素、莰菲醇、金絲桃苷、白藜蘆醇等［3］，具有降低血糖、血脂和尿糖的“三降”作用，對(duì)糖尿病、腦血管硬化、高血脂、心血管疾病具有預(yù)防和治療的作用。

目前，苦蕎的研究多涉及種子、芽、葉、麩皮和殼中黃酮提取工藝的優(yōu)化、組分鑒別及其抗氧化活性［4］。苦蕎秸稈資源豐富，實(shí)驗(yàn)證明其含有黃酮類物質(zhì)，如劉紅等［5］借助微波輔助技術(shù)優(yōu)化了苦蕎秸稈中總黃酮的提取工藝，在最佳工藝條件下總黃酮的提取率為1.53%；王敏等［6］結(jié)合纖維素酶法優(yōu)化了水提黃酮的提取工藝，優(yōu)化后的總黃酮提取率為1.47%，是未經(jīng)酶解提取率的3.08倍。酶法結(jié)合超聲波的空化作用、機(jī)械效應(yīng)、凝聚效應(yīng)，能夠有效地提高總黃酮的溶出效率。本研究采用秦巴苦蕎稈為試驗(yàn)原料，以總黃酮的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，纖維素酶結(jié)合超聲波輔助醇提法提取苦蕎稈中的總黃酮，并對(duì)其抗氧化性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為苦蕎稈資源在飼料工業(yè)中的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

苦蕎稈：采摘于陜西省鎮(zhèn)巴縣，50℃烘干，粉碎，過80目篩備用；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：中國藥品生物制品檢定所；纖維素酶（10 000 U/g）、鄰二氮菲、鄰苯三酚、2，2-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）、維生素C、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、無水乙醇、亞硝酸鈉（均為分析純）：阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

AL204-IC型電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Cary50紫外可見分光光度計(jì)：美國瓦里安公司；SB-4200DTD型超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；JXL-2S-6A數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市金祥龍電子有限公司；101A-1電熱鼓風(fēng)干燥箱：重慶銀河試驗(yàn)儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；800型離心機(jī)：上海手術(shù)器械廠。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

依據(jù)NaNO2-Al（NO3）3比色法，于波長510nm處測(cè)定吸光度值［7］，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（C，mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得線性回歸方程為：A=10.183C-0.001 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。

1.3.2苦蕎桿黃酮的提取及含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取1.0000 g苦蕎稈粉置于50 mL圓底燒瓶中，加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，再加緩沖溶液調(diào)節(jié)pH值，50℃恒溫水浴酶解1 h，酶解完全后轉(zhuǎn)移至超聲波清洗機(jī)中設(shè)定功率為250W提取，真空泵抽濾，2 000 r/min離心5 min。取一定體積離心液于50mL容量瓶中，依據(jù)NaNO2/Al（NO3）3比色法在波長510 nm處測(cè)定苦蕎桿黃酮的吸光度值，根據(jù)回歸方程計(jì)算提取液中總黃酮的含量C，由下式計(jì)算超聲輔助提取苦蕎稈總黃酮的提取率：

式中：V為樣品液體積，mL；C為苦蕎稈總黃酮提取液質(zhì)量濃度，mg/mL；N為提取液稀釋倍數(shù)，M為稱取的苦蕎稈粉末質(zhì)量，g。

1.3.3單因素試驗(yàn)

選取影響酶法-超聲輔助提取苦蕎稈中總黃酮提取率的6個(gè)因素，考察各個(gè)因素對(duì)苦蕎稈中總黃酮提取率的影響。考察單個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率的影響時(shí)，分別改變所對(duì)應(yīng)的設(shè)定因素，固定pH值為6，超聲功率為250 W。纖維素酶用量設(shè)定水平分別為：4 mg/g、6 mg/g、8 mg/g、10mg/g、12mg/g；乙醇體積分?jǐn)?shù)的設(shè)定水平為：20%、30%、40%、50%、60%；料液比的設(shè)定水平為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g∶mL）；超聲溫度設(shè)定水平為：20℃、30℃、40℃、50℃、60℃；超聲時(shí)間設(shè)定為10min、20min、30min、40min、50min。

1.3.4正交試驗(yàn)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，精確稱取1.000 0 g的苦蕎稈粉末，設(shè)定超聲波功率250 W，調(diào)節(jié)緩沖溶液pH值為6，以纖維素酶量、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲溫度和超聲時(shí)間為正交試驗(yàn)的5個(gè)影響因子，通過L16（45）正交試驗(yàn)優(yōu)化苦蕎稈中總黃酮的提取工藝，具體因素與水平見表1。

表1　總黃酮提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for total flavonoids extraction conditions optimization

1.3.5苦蕎桿總黃酮的抗氧化性研究

依據(jù)Oyaizu法［8］評(píng)價(jià)苦蕎桿總黃酮的還原能力，鄰苯三酚自氧化體系［9］評(píng)價(jià)苦蕎桿總黃酮清除超氧陰離子自由基能力，鄰二氮菲-Fe2+氧化體系［10］評(píng)價(jià)苦蕎桿總黃酮清除羥自由基活性，過硫酸鉀氧化ABTS法［11］評(píng)價(jià)苦蕎桿總黃酮清除ABTS+·能力。各自由基的清除公式如下：

式中：A0為自由基溶液的吸光度值；A樣品為測(cè)定樣品的吸光度值；A1為測(cè)定黃酮溶液自身的吸光度值；A損傷為只加自由基溶液的吸光度值；A未損為不加入樣品和過氧化氫溶液的吸光度值。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1纖維素酶量對(duì)苦蕎桿總黃酮提取率的影響

纖維素酶能夠有效破壞苦蕎桿的纖維素，促使總黃酮的溶出［12］。纖維素酶量對(duì)總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖1。

圖1　纖維素酶量對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of cellulase dosage on total flavonoids extraction rate

由圖1可知，隨著纖維素酶用量的增加，易于苦蕎桿細(xì)胞壁的破碎，總黃酮的提取率逐漸增加，酶添加量為10 mg/g時(shí)，總黃酮提取率最大，進(jìn)一步增加纖維素酶，提取率反而有所降低。可能的原因是隨著纖維素酶量的增加，總黃酮的溶出率逐漸增加，但是過多的酶具有黏附性能，阻塞黃酮的溶出通道，因此其提取率有所下降，故最佳的纖維素酶添加量為10 mg/g。

2.1.2乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)苦蕎桿總黃酮提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，伴隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，總黃酮提取率的趨勢(shì)是先增大后減小。乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%～30%，提取率逐漸增大，這是因?yàn)榭嗍w稈總黃酮的溶出隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到30%時(shí)，提取率達(dá)到最大值，說明在該試驗(yàn)條件下苦蕎稈總黃酮的浸出達(dá)到最大值；乙醇體積分?jǐn)?shù)超過30%后，即使繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，總黃酮的浸出卻逐步降低，可能是濃度過大，一些易溶于醇的物質(zhì)與黃酮競(jìng)爭(zhēng)性地浸出，從而致使總黃酮的提取率降低。故最佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%。

圖2　乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on total flavonoids extraction rate

2.1.3超聲溫度對(duì)苦蕎桿總黃酮提取率的影響

圖3　超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on total flavonoids extraction rate

超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知，苦蕎稈中總黃酮的提取率隨溫度的升高而增加，可能是超聲波的空化作用促使植物細(xì)胞壁破裂，總黃酮的溶出效果增加，30℃時(shí)達(dá)到峰值，之后隨溫度的增加提取率的增加較為緩慢，這可能是升高溫度促使浸提液黏度降低，黃酮在乙醇中的溶解度增大，使黃酮類化合物的提取率也隨著溫度的升高而增大，綜合考慮苦蕎稈中總黃酮的超聲溫度宜選取30℃。

2.1.4超聲時(shí)間對(duì)苦蕎桿總黃酮提取率的影響

圖4　超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on total flavonoids extraction rate

由圖4可知，隨著超聲時(shí)間的加長，提取率先增大后減小。在30 min以前，隨著時(shí)間延長，提取率也大幅度增大，因?yàn)殡S著提取時(shí)間的增加總黃酮在乙醇溶液中逐漸溶出；當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)提取率達(dá)到峰值，隨后提取率反而緩慢降低，這可能是由于超聲時(shí)間加長，溶液黏度增大的同時(shí)增大傳質(zhì)阻力，對(duì)黃酮的溶出產(chǎn)生了影響；此外超聲波的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)，可能引起黃酮類分解，因此，選擇超聲時(shí)間30 min為宜。

2.1.5料液比對(duì)苦蕎桿總黃酮提取率的影響

圖5　料液比對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on total flavonoids extraction rate

料液比對(duì)總黃酮提取率的影響見圖6。由圖6可知，隨著液料比的增大，苦蕎桿中總黃酮的提取率是先增加后降低最后趨于平緩，其原因是隨著液料比的增加，超聲波在液體中能夠達(dá)到有效的攪動(dòng)和流動(dòng)，在1∶30（g∶mL）時(shí)達(dá)到峰值。隨著液體的進(jìn)一步增加，樣品中的有效濃度逐漸降低，超聲波對(duì)溶液中微粒樣品的凝聚作用相對(duì)減弱，提取率逐漸下降。進(jìn)一步延長提取時(shí)間，提取效果趨于平緩。綜合后續(xù)處理因素，料液比選擇1∶30（g∶mL）為宜。

2.2正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定超聲波功率250 W，檸檬酸鈉緩沖溶液的pH值6，選取纖維素酶量、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度、超聲時(shí)間和料液比為評(píng)價(jià)因素，采用L16（45）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2　總黃酮提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for total flavonoids extraction conditions optimization

由表2可知，對(duì)苦蕎稈中總黃酮提取率的影響因素主次順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)＞超聲時(shí)間＞纖維素酶＞料液比＞提取溫度，最佳提取條件為A3B3C3D2E3，即纖維素酶10 mg/g，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，超聲溫度為40℃，超聲時(shí)間30 min，料液比為1∶40（g∶mL）。

2.3驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)最佳提取工藝進(jìn)行3次平行試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果得到苦蕎稈總黃酮的平均得率為2.30%。以不加纖維素酶最優(yōu)條件下平行試驗(yàn)得到苦蕎桿黃酮的得率僅為1.55%，可見酶法的提取效果明顯高于傳統(tǒng)提法，為以后秸稈資源的綜合利用開發(fā)提供依據(jù)。

2.4苦蕎稈總黃酮的抗氧化活性研究

2.4.1清除羥自由基（·OH）

圖6　苦蕎稈黃酮和VC對(duì)羥基自由基的清除活性Fig.6 Scavenging activity ofFagopyrum tataricumstraw flavonoids and vitamin C on·OH

由圖6可知，隨著樣品濃度升高，苦蕎稈總黃酮對(duì)·OH的清除活性逐漸增強(qiáng)且存在明顯的量效關(guān)系［14］。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.28mg/mL時(shí)，苦蕎稈黃酮對(duì)·OH的清除率為96.35%，其清除半抑制濃度（50%inhibitory concentration，IC50）值為0.18 mg/mL；而相同質(zhì)量濃度下的VC對(duì)·OH的清除率為58.73%，說明苦蕎稈總黃酮對(duì)·OH具有一定的清除效果，其清除效果較優(yōu)于VC溶液。

超氧陰離子自由基由氧分子結(jié)合一個(gè)電子構(gòu)成，通過在生物體內(nèi)長期攻擊靶向目標(biāo)，破壞細(xì)胞DNA，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂或蛋白氧化損傷，誘發(fā)氧化應(yīng)激，繼而導(dǎo)致各種腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等［15］。由圖7可知，隨苦蕎稈總黃酮質(zhì)量濃度升高，其對(duì)清除活性增強(qiáng)，并表現(xiàn)為良好的劑量關(guān)系。當(dāng)苦蕎稈總黃酮質(zhì)量濃度為0.28 mg/mL時(shí)，苦蕎稈總黃酮對(duì)的清除率為62.85%，其清除IC50值為0.24 mg/mL；而相同濃度條件下的VC溶液清除率僅為25.32%。結(jié)果表明，苦蕎稈總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果強(qiáng)于同濃度條件下的VC溶液。

圖7　苦蕎稈黃酮和VC對(duì)清除活性Fig.7 Scavenging activity ofFagopyrum tataricumstraw flavonoids and vitamin C on

2.4.3清除ABTS自由基正離子（ABTS+·）

ABTS+·是一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的自由基正離子，常用于評(píng)價(jià)抗氧化溶液的總抗氧化能力［16］。本試驗(yàn)以苦蕎稈總黃酮提取液為反應(yīng)液，隨著樣品質(zhì)量濃度的升高，其對(duì)ABTS+·清除率逐漸增大，并且呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。當(dāng)加入苦蕎提取液2.76 μg/mL時(shí)，其對(duì)ABTS+·清除率為75.41%，其清除IC50值為2.24 μg/mL；配制相同濃度的VC為參照，當(dāng)加入常規(guī)抗氧化劑VC 0.46 μg/mL時(shí)，對(duì)ABTS+·清除率小于5%，隨著樣品質(zhì)量濃度升高，清除活性緩慢增強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度為2.76 μg/mL時(shí)，其對(duì)ABTS+·清除率為33.00%，結(jié)果顯示，苦蕎桿黃酮清除ABTS+·活性較優(yōu)于常規(guī)自由基清除劑VC。

圖8　苦蕎稈黃酮和VC對(duì)ABTS+·清除活性Fig.8 Scavenging activity ofFagopyrum tataricumstraw flavonoids and vitamin C on ABTS+·

2.4.4還原能力的測(cè)定

本試驗(yàn)以苦蕎稈總黃酮被鐵氰化鉀氧化來表征其還原力，其在波長700 nm處的吸光度值越大，表示其還原力越強(qiáng)［17］。由圖9可知，隨著樣品質(zhì)量濃度升高，總黃酮和VC于波長700 nm處的吸光度值逐漸增大，并且存在良好的線性關(guān)系，表明其還原能力逐漸增強(qiáng)；苦蕎稈總黃酮的總體還原能力強(qiáng)于常規(guī)抗氧化劑VC。

圖9　苦蕎稈黃酮和VC還原能力的測(cè)定Fig.9 Reducing capacity ofFagopyrum tataricumstraw and vitamin C

3　結(jié)論

采用單因素試驗(yàn)，評(píng)價(jià)不同提取條件下總黃酮的提取率，設(shè)定超聲波功率250 W，緩沖溶液pH值6.0。結(jié)合正交試驗(yàn)，探索了苦蕎稈總黃酮的最佳提取工藝條件為纖維素酶10 mg/g，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，超聲溫度為40℃，超聲時(shí)間30 min，料液比為1∶40（g∶mL）。在最佳試驗(yàn)條件下平行3組總黃酮的得率為2.30%，各因素的影響次序?yàn)椋阂掖俭w積分?jǐn)?shù)＞超聲時(shí)間＞纖維素酶＞料液比＞提取溫度。

自由基清除活性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，苦蕎稈總黃酮具有較強(qiáng)的清除·OH、ABTS+·能力和還原能力，總黃酮對(duì)·OH、·、ABTS+·的半抑制濃度（IC50值）為0.181 mg/mL、0.235 mg/mL和2.240 μg/mL。對(duì)ABTS·+的清除效果最強(qiáng)，且苦蕎桿對(duì)三者的清除作用都高于VC對(duì)其的清除作用。而且在試驗(yàn)范圍內(nèi)對(duì)三者的抗氧化活性呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，結(jié)果可為苦蕎稈資源在飼料工業(yè)的合理開發(fā)及應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

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Enzymatic-ultrasonic assisted extraction of total flavonoids fromFagopyrum tataricum straw and its antioxidant activity

YANG Haitao，CAO Xiaoyan*
（1.Shaanxi Key Laboratory of Catalysis，Shaanxi Sci-Tech University，Hanzhong 723000，China；2.School of Chemical&Environmental Sciences，Shaanxi Sci-Tech University，Hanzhong 723000，China）

TakingFagopyrum tataricumstraw from Qinba area as raw material，based on single factor experiments and orthogonal experiments，the extraction technology of total flavonoids fromF.tataricumstraw was studied by cellulase-ultrasonic method.The scavenging activity of total flavonoids on·OH，O2-·，ABTS+·and reducing power were investigated.The results showed that the optimum flavonoid extraction technology ofF. tataricumstraw was as follows：cellulase dosage 10 mg/g，ethanol concentration 40%，ultrasonic temperature 40℃，time 30 min and solid-liquid ratio 1∶40（g∶ml）.Under this condition，the extraction yield of total flavonoids was 2.30%.The IC50of total flavonoids towards·OH，O2-·，ABTS+·were 0.18 mg/ml，0.24 mg/ml and 2.24 μg/ml，respectively，which was superior to the natural antioxidants vitamin C.

Fagopyrum tataricumstraw；total flavonoids；cellulose；ultrasonic-assisted extraction；antioxidant activity

S567.9

0254-5071（2016）09-0072-05doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.017

2016-04-01

陜西省教育廳專項(xiàng)科研計(jì)劃（2013JK0680）；陜西理工學(xué)院校級(jí)人才啟動(dòng)項(xiàng)目（SLGQD13-1）

楊海濤（1960-），男，教授，本科，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。

曹小燕（1982-），女，講師，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。