基于立方體納米氧化亞銅修飾的安培型葡萄糖生物傳感器的制備及性能研究

馬真真 余會成 吳朝陽 吳燕 肖福兵

摘要：將合成的立方體納米氧化亞銅用于修飾玻碳電極，在其上固定葡萄糖氧化酶，構建了高靈敏的安培型葡萄糖生物傳感器。采用X射線衍射（XRD）、掃描電鏡（SEM）對合成的立方體納米氧化亞銅及其修飾電極進行了表征。結果表明，合成的納米氧化亞銅為均勻的立方體形狀。采用循環伏安法 （CV）、交流阻抗譜 （EIS）、差分脈沖伏安法 （DPV） 及計時電流法 （CA）考察了修飾電極的電化學行為。在含0.1 mmol/L葡萄糖的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）中研究了立方體納米氧化亞銅修飾電極的循環伏安（CV）響應，實驗結果表明，此修飾電極對葡萄糖顯示出良好的電催化性能。DPV響應電流與葡萄糖的濃度在5.0×10mol/L（S/N=3）。CA實驗結果表明，尿酸、抗壞血酸、D果糖對傳感器不產生干擾。本傳感器具有較好的重現性和穩定性，可用于實際樣品中葡萄糖的檢測。

關鍵詞 ：立方體納米氧化亞銅； 葡萄糖氧化酶； 葡萄糖； 電催化； 生物傳感器

1 引 言

葡萄糖濃度的準確檢測在臨床醫學、生物學、環境科學、食品分析等領域極為重要[1]。目前，測定葡萄糖濃度的方法主要有分光光度法[2]、熒光檢測法[3]、高效液相色譜法[4]及毛細管電泳法[5]等，這些方法大多數靈敏度低或耗時長、成本較高。電化學傳感器具有靈敏度高、響應時間短、線性范圍寬、成本低并且可在線檢測等優點，因此電化學葡萄糖生物傳感器已經成為研究熱點之一[6]。

目前，電化學葡萄糖傳感器多采用葡萄糖氧化酶 （GOx）修飾電極[7]。直接將GOx涂滴在電極表面上，GOx很容易喪失活性，電子傳遞也較慢；采用殼聚糖或Nafion等成膜，通過戊二醛交聯，可將GOx固定在電極表面膜上，但固定的GOx在電極上的電子傳遞受到明顯抑制，因此所構建的電化學傳感器的靈敏度較低。

納米材料具有較大比表面積、良好的電子傳遞能力[8]，鉑、金、銀、碳納米管、石墨烯等納米材料已被廣泛用于修飾GOx傳感電極表面，以提高檢測葡萄糖的靈敏度[9～11]。納米材料的電催化性能不但取決于材料尺寸及元素組成，還取決于材料的形貌，高表面能的晶面常比低表面能的晶體表現出更高的電催化活性[12～15]。納米氧化亞銅作為新型的p 型氧化物半導體材料， 具有活性的電子空穴對， 表現出良好的電催化活性[16]。Li等[17]制備了正八面體納米氧化亞銅與碳納米量子點復合物修飾的非酶性葡萄糖傳感器；Khan等[18]發現飛鏢狀納米氧化亞銅可在葡萄糖的檢測中表現出良好的電催化效果。

為了提高電化學方法檢測葡萄糖的靈敏度，本研究合成了立方體納米氧化亞銅，構建了基于立方體納米氧化亞銅修飾電極的安培型葡萄糖生物傳感器，采用循環伏安法（CV）、交流阻抗 （EIS）技術、差分脈沖伏安法 （DPV）及計時電流法 （CA）對修飾電極的電化學行為進行了研究，考察了其對葡萄糖的分析性能。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

CHI660E型電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）；PHS3C型pH計（上海雷磁儀器廠）；Ultima Ⅳ型X射線衍射儀（日本理學株式會社）；SUPRA 40/40VP場發射掃描電鏡（德國卡爾蔡司公司）。

葡萄糖氧化酶 （Glucose oxidase， GOx， E. C1. 1. 3. 4， 234， 900 units/g）、 尿酸 （UA， 純度 99%）、L抗壞血酸 （AA， 純度 99%）、D果糖 （Fru， ≥99.0% （HPLC））、牛血清白蛋白 （凍干粉， Protease， essentially free， ≥98%）、二茂鐵 （98%）、葡萄糖 （≥99.5% （GC））均購自Sigma 公司；CuCl2 （純度99%）、NaOH （純度99.9%）、丙酮 （純度99.7%）及無水乙醇 （純度99.7%）均購自天津科密歐化學試劑廠。除非特殊說明，所有試劑均為分析純。實驗用水為超純水 （18.3 MΩ cm）。

2.2 實驗方法

2.2.1 立方體納米氧化亞銅的合成 立方體納米氧化亞銅的合成參考文獻＼[19＼]并稍作改進。將1.0 mL 0.1 mol/L CuCl2溶液及1.0 mL 0.5 mol/L NaOH溶液加入到50 mL超純水中，持續攪拌，出現藍色的Cu（OH）2沉淀后再攪拌5 min。然后加入1.0 mL 0.1 mol/L抗壞血酸溶液，沉淀由藍色變成黃色，最后又變成磚紅色。反應30 min后，10000 r/min離心5 min，并用超純水洗滌沉淀3次，沉淀最后保存在乙醇溶液中。

2.2.2 修飾電極的制備 將玻碳電極（GCE， Φ=2 mm）表面依次用0.3和0.05 μm的Al2O3粉末拋光成鏡面，然后依次用超純水、稀HNO3（1∶1， V/V）、乙醇、超純水各超聲清洗5 min。

將5 mL 立方體納米氧化亞銅 （8.0 mg/mL）懸濁液分散在 5 mL 5% Nafion溶液中，然后取8 μL溶液均勻滴涂在電極表面，置于紅外燈下，揮發干溶劑后，滴涂6 μL 1.25% （V/V）戊二醛，然后滴涂8 μL 含有10 mg/L葡萄糖氧化酶、8. 0 mg/L 牛血清白蛋白及5.0 mg/L二茂鐵 （電子媒介體）的混合溶液，在室溫下放置晾干8 h， 用磷酸鹽緩沖溶液 （PBS）洗去多余的反應物，干燥后即得葡萄糖氧化酶立方體納米氧化亞銅修飾電極 （GOx/Cu2O/GCE）。 無納米氧化亞銅修飾的葡萄糖氧化酶電極 （GOx/GCE）的制備除了不加立方體納米氧化亞銅外，其余步驟同上。

2.2.3 電化學測試 采用三電極體系：修飾GCE電極為工作電極，甘汞電極為參比電極，鉑絲為對電極為。在含有不同濃度葡萄糖的0.1 mol/L Na2HPO4KH2PO4緩沖溶液 （PBS，pH 7. 4）中進行CV， DPV及CA測試。

3 結果與討論

3.1 材料及修飾電極的表征

采用抗壞血酸還原法制備的納米氧化亞銅的X射線衍射（XRD）圖譜、掃描電鏡（SEM）圖及其修飾電極的SEM圖如圖1所示。由圖1a可見，XRD譜中所有的衍射峰都與氧化亞銅立方晶系的標準圖譜相對應 （JCPDS 5667，晶胞參數a=0.4269 nm）， 且具有較高的衍射強度，峰形尖銳，表明產物結晶性較好；合成的材料無雜質峰， 表明產物晶型單一，晶體純度高。由圖1b可見，制備的納米氧化亞銅呈立方體形狀，分散性良好，大小均勻，粒徑約為80 nm。從圖1c可見，納米氧化亞銅在玻碳電極表面分布均勻，有利于電極表面上進行的電催化反應。

3.2 立方體納米氧化亞銅修飾電極的電化學表征

葡萄糖氧化酶 （GOx）催化氧化溶液中的葡萄糖生成葡萄糖酸內酯及H2O2，H2O2 的生成量與溶液中葡萄糖的含量相關，電子媒介體二茂鐵能夠與電極表面上GOx的氧化還原中心進行有效的傳輸電子，使反應不斷進行，因此可通過檢測酶催化反應釋放的H2O2間接檢測溶液中葡萄糖的濃度[20]。

玻碳電極 （GCE，曲線a）、無（GOx/GCE，曲線b）及有 （GOx/Cu2O/GCE，曲線c）納米氧化亞銅的葡萄糖氧化酶修飾電極在含有0.1 mmol/L葡萄糖的PBS緩沖溶液中的循環伏安圖如圖2所示，玻碳電極 （曲線a）未出現氧化還原峰；GOx/GCE電極的循環伏安曲線上出現了一對氧化還原峰，為H2O2的氧化還原峰，但峰電流較小。這是因為GOx包埋固定在電極表面膜上，其電子傳遞受到抑制；而GOx/Cu2O/GCE電極的循環伏安曲線出現一對明顯的氧化還原峰，且峰電流與GOx/GCE相比顯著增大，說明納米氧化亞銅對葡萄糖氧化具有顯著的電催化作用。

采用K3＼[Fe（CN）6＼]/K4＼[Fe（CN）6＼]作為電子探針測定制備的葡萄糖氧化酶納米氧化亞銅修飾玻碳電極上的交流阻抗譜。交流阻抗Nyquist圖中高頻區的半圓的直徑對應于電極表面的電荷轉移電阻（Rct），半圓直徑越小，電荷轉移電阻越小，電子在電極表面上的電子轉移越容易[21]。

玻碳電極 （GCE，曲線a）、無立方體納米氧化亞銅（GOx/GCE，曲線b）及有立方體納米氧化亞銅（GOx/Cu2O/GCE，曲線c）的葡萄糖氧化酶修飾電極在含有10 mmol/L K3＼[Fe（CN）6＼]/K4＼[Fe（CN）6＼]的0.1 mol/L PBS緩沖溶液中的交流阻抗Nyquist圖如圖3所示，無納米氧化亞銅的葡萄糖氧化酶修飾電極的半圓的直徑最大（曲線b），這是由于葡萄糖氧化酶固定在電極表面膜上，包埋固定的GOx阻礙了探針在電極上的電子傳遞。當采用立方體納米氧化亞銅修飾電極后，半圓的直徑顯著變小，說明立方

體納米氧化亞銅可以有效地加速電子在電極表面上的傳遞。玻碳電極及各修飾電極的交流阻抗譜的結果與循環伏安的研究結果一致。

3.4 傳感器選擇性和穩定性

采用計時電流法，考察了不同干擾物對本傳感器的干擾情況。在攪拌的條件下，連續添加0.1 mmol/L的尿酸 （UA）、抗壞血酸 （AA）、D果糖 （Fru）及目標物葡萄糖 （Glu），實驗結果如圖5所示。以上干擾物引起的干擾電流較小，可以忽略不計，表明GOx/Cu2O/GCE的選擇性良好。

采用差分脈沖伏安法對0.1 mmol/L葡萄糖溶液（0.1 mol/L PBS，pH 7.4）進行測試，5 次平行測定的峰電流相對標準偏差為2.9%，表明檢測的重現性良好。制備了5 支相同的修飾電極，測得葡萄糖峰電流的相對標準偏差為3.6%，表明此電極具有良好的制備重現性。將電極于室溫下放置2個月后，其響應電流下降3.9%，表明此電極具有良好的穩定性。

3.5 實際樣品分析

采用GOx/Cu2O/GCE對糖尿病人的尿液中的葡萄糖含量進行測定。取5 mL尿液，加入5 mL 0.2 mol/L PBS （pH 7.4）緩沖溶液， 采用GOx/Cu2O/GCE及1816拜安康血糖分析儀（德國拜耳公司）對樣品分別進行測定，4個尿樣的檢測結果見表1。

兩種方法的測定結果一致，表明所構建的傳感器可用

[DZ（20，24]于實際樣品分析。

4 結 論

采用抗壞血酸還原法制備了立方體納米氧化亞銅，用于修飾玻碳電極，在葡萄糖的測定中呈現出顯著的電催化作用。構建的基于葡萄糖氧化酶立方體納米氧化亞銅修飾電極的電化學傳感器具有線性范圍寬、靈敏度高、檢出限低、選擇性及穩定性好等優點，可用于實際樣品中葡萄糖的分析檢測。

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Abstract A highly sensitive amperometric glucose biosensor was fabricated by using the synthesized nanocube copper oxide （Cu2O）. The synthesized nanoCu2O and the modified electrode were characterized using Xray diffraction （XRD）， scanning electron microscopy （SEM）. The results showed that the obtained samples were nanocube Cu2O. The electrochemical properties of the modified electrode were investigated by cyclic voltammetry （CV）， differential pulse voltammetry （DPV）， electrochemical impedance spectroscopy （EIS）， and chronoamperometry （CA）. The CV behavior of nanocube Cu2O modified sensor was examined in 0.1 mol/L PBS （pH 7.4） containing 0.1 mmol/L glucose. The experimental results showed the prepared sensor presented remarkably enhanced electrocatalytic activity towards glucose detection. Linear responses of the sensor to glucose were observed for gulcose concentrations ranging from 5.0×10mol/L （S/N=3）. The CA results showed that the interference from potential interfering species such as uric acid， ascorbic acid， and D fructose could be ignored. In addition， the developed sensor exhibited good repeatability and stability， and was successfully applied to the determination of glucose in real urea samples from diabetics.

Keywords Nanocube copper oxide； Glucose oxidase； Glucose； Electrocatalysis； Biosensor