聚合物/磷酸鹽雙水相分離乳清分離蛋白中α—乳白蛋白和β—乳球蛋白條件的優化

張鶴 姜彬 馮志彪 屈玉霄 李璇

摘要：建立了基于聚（乙二醇ran丙二醇）單丁基醚（聚合物）與磷酸鹽、氯化鈉的雙水相體系對乳清分離蛋白（WPI）中的α乳白蛋白（αLA）和β乳球蛋白（βLG）進行分離，并對其分離條件進行了優化。系統地研究了雙水相體系pH值、聚合物與KH2PO4溶液體積比、NaCl添加量和WPI濃度對αLA和βLG的分離效果的影響， 采用液相色譜法對αLA和βLG的分離效果進行評價。結果表明，聚合物/KH2PO4雙水相體系pH=4.0， 40%（m/m）聚合物與15.5%（m/m）KH2PO4的體積比為4 mL∶4 mL，NaCl添加量為0.40 g/10 mL， WPI濃度為1 mg/mL時，αLA和βLG分離效果最好，上相中αLA的萃取率為98.2%，下相中βLG的萃取率為96.6%。

關鍵詞 ：雙水相； 乳清分離蛋白； 聚（乙二醇ran丙二醇）單丁基醚； 分離

1 引 言

乳清分離蛋白（WPI）是蛋白質混合物，在乳清分離蛋白中，α乳白蛋白（αLA）和β乳球蛋白（βLG）的含量占總WPI含量的80%以上[1]，并被廣泛應用于食品、醫藥、精細化工等領域，因此具有很高的商業價值[2，3]。現已發現αLA具有多種生理功能，人αLA可以被轉化成一種可以誘導腫瘤細胞凋亡的蛋白質，牛αLA也可以被轉化成這種對腫瘤細胞有相似活性的物質。在αLA中發現有血管緊張素轉移酶（ACE）抑制活性，含有ACE抑制肽的水解產物已經用于高血壓患者的血壓控制。βLG具有優異的熱與冷凝膠特性以及良好的氨基酸譜。然而，兒童對βLG有過敏效應，因此在水解或脫除這種蛋白質后再應用于嬰兒或低敏人群[4]。

近年來，雙水相體系（ATPS）常應用于分離乳蛋白中各種單體蛋白質。2011年，Jara等[5]采用乳清分離蛋白濃縮物（WPC）/羥丙基甲基纖維素作為雙水相體系， 分離WPC中的αLA和βLG，結果表明，分子量低的蛋白質αLA和βLG均被保留在上相，分配比例高達90%，但兩種蛋白未能分開。Alcntara等[4，6]利用響應面分析法優化WPI在PEG/磷酸鹽雙水相和PEG/NaPA雙水相體系中的分配情況，實驗結果表明，PEG相只含有αLA，但鹽相中除含有βLG外，還含有部分αLA。Sivakumar等[7]利用PEG1000/檸檬酸鈉雙水相體系分離乳清蛋白中的αLA和βLG，在最適條件下，αLA在上相分配系數為16.67，βLG在下相分配系數為0.27。Kalaivani等[8]利用PEG1000/檸檬酸鈉雙水相體系分離乳清蛋白中的αLA和βLG，通過響應面協同節線長度、pH值、體積比和乳清蛋白濃度等變量的相互作用，優化出最佳提取條件，使上相中αLA的提取率為89%，純化率為96%，下相中βLG的提取率為96%，純化率為76%，但此體系對αLA的提取率偏低。

聚（乙二醇ran丙二醇）單丁基醚（聚合物）是一種水溶性聚合物， 可與合適的鹽溶液混合， 構成雙水相體系。 Chen等[9]利用Poly （ethylene glycolranpropylene glycol）（EOPOL31）/磷酸鹽雙水相體系結合高效液相色譜法成功分離、富集和測定了牛奶、雞蛋和蝦產品中的環丙沙星（CIP），CIP的萃取率最高可達97.7%。Dembczyński等[10]利用環氧乙烷環氧丙烷共聚物（EO50PO50）/磷酸鹽雙水相體系分離溶菌酶，并利用響應面模型計算分配系數K和上相中酶的產率，實驗結果與響應面模型計算結果一致。本研究采用聚（乙二醇ran丙二醇）單丁基醚（分子量3900）與磷酸鹽形成雙水相體系， 分離WPI中αLA和βLG， 通過液相色譜監測，系統地研究了雙水相體系的pH值、WPI濃度、NaCl添加量和聚合物與磷酸鹽體積比對分離效果的影響，優化出最佳提取條件。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

1260半制備液相色譜儀， 配紫外可見檢測器 和ChemStation工作站（美國Agilent公司）； SC3610型低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；A150011型渦流混勻器（南京佳俊生物有限公司）；FE201EL20型pH計，AL04電子分析天平（梅特勒托利多儀器（上海）有限公司）。

WPI（上海諾申食品貿易有限公司，蛋白質含量88%±4.5%）；αLA和βLG標準品（美國Sigma公司）；聚（乙二醇ran丙二醇）單丁基醚（Poly（ethylene glycolranpropylene glycol） monobutyl ether， Mn～3900，美國Sigma公司）；乙腈、三氟乙酸（色譜純，美國Dikma公司）；其它試劑均為分析純。

2.2 相圖測定

以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，αLA在 0.1～2.5 mg/mL、βLG在 0.2～5.0 mg/mL濃度范圍內線性關系良好，αLA和βLG線性方程分別為y=1414.2x-129.86（R2=0.9998）和y=473.47x+16.008（R2=0.9989）。 將WPI進行液相色譜分析所得到的αLA和βLG的含量分別為19%和73%，與市售WPI中αLA和βLG標注含量基本一致。

3.3 雙水相組成對αLA和βLG分離的影響

3.3.1 pH值對αLA和βLG分離的影響 分別考察了加入2 mL 10 mg/mL WPI溶液，0.40 g/10 mL NaCl固體，40%（m/m）聚合物溶液與15.5%（m/m）磷酸鹽溶液體積比為5∶3的雙水相系統對αLA和βLG分離的影響，結果如表2所示，雙水相體系上下相的液相色譜圖見圖3和圖4。

WPI濃度不影響聚合物/KH2PO4雙水相體系對αLA和βLG分離，但從表3可見，隨著WPI濃度增大，αLA萃取率反而下降，WPI濃度大于3 mg/mL時，雙水相分界層會有白色沉淀析出，下相體積變大，導致相比變小，同時βLG萃取率變大。當WPI濃度較低時，相比基本相等。而αLA是疏水性蛋白，βLG是親水性蛋白[16]，富含聚合物相比富含鹽相具有更大的疏水性，聚合物相中可用于相互作用和溶解的自由水很少，所以加入高濃度WPI的雙水相中間層會出現αLA沉淀，導致萃取率顯著降低。1 mg/mL WPI對聚合物/KH2PO4雙水相體系分離αLA和βLG較為有利。

3.3.3 NaCl添加量對αLA和βLG分離的影響 在聚合物/K2HPO4（5∶3， V/V）雙水相體系中分別加入0.30 g/10 mL、0.35 g/10 mL、0.40 g/10 mL NaCl，考察體系對1 mg/mL WPI的萃取效果，如表4。

聚合物/KH2PO4的體積比分別為5 mL∶3 mL和4 mL∶4 mL時，雙水相體系能將WPI中αLA和βLG分離，但體積比為5 mL∶3 mL的雙水相體系上下相中αLA和βLG萃取率比較低，體積比為3 mL∶5 mL的雙水相體系上相中還有部分βLG。從表5可見，聚合物與KH2PO4體積比為4∶4時的雙水相體系對αLA和βLG的萃取率更高一些，分離效果也更好。這是因為隨著聚合物含量的增加，界面張力增大，同時聚合物相體積增大，相比增大，從而促進其與疏水性蛋白質的相互作用[18]。綜合考慮，選取聚合物和磷酸鹽的體積比為4 mL∶4 mL， 即相比為1.0時， 為WPI中αLA和βLG的最佳條件。

4 結 論

考察了聚合物（聚（乙二醇ran丙二醇）單丁基醚）/磷酸鹽雙水相體系分離WPI中αLA和βLG的條件。研究結果表明，在加入40%（m/m）聚合物溶液與15.5%（m/m）KH2PO4溶液體積比為4 mL∶4 mL，加入WPI濃度為1 mg/mL及NaCl固體添加量為0.40 g/10 mL時，構成的雙水相系統對αLA和βLG分離效果最佳，αLA和βLG萃取率分別為98.23%和96.56%。αLA和βLG分別進入上下相，有利于后續的進一步分離純化。與傳統的PEG/鹽形成的雙水相[7，8]萃取αLA和βLG相比，聚合物/KH2PO4雙水相分離效果更好，單一變量變化圖更直觀可見，萃取率更高，聚合物在室溫下穩定，萃取過程中無有害物質生成，且聚合物相在較低溫度與水溶液形成分層，利用工業化回收進行二次使用，達到了綠色環保的效果。

References

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Abstract Poly （ethylene glycolranpropylene glycol） monobutyl ether/phosphate aqueous twophase system （ATPS） coupled with high performance liquid chromatography （HPLC） was developed for the separation of αlactalbumin （αLA） and βlactoglobulin （βLG） in whey protein isolate （WPI）. The main parameters relating to this method were investigated and optimized. The effects of pH value， volume ratio of polymer and KH2PO4 solutions， concentration of NaCl and WPI on the partition of αLA and βLG in WPI were investigated. The results showed that efficient separation of both proteins in WPI could be achieved by using the ATPS with 4 mL poly （ethylene glycolranpropylene glycol） monobutyl ether solution （40%， m/m） and 4 mL KH2PO4 solution （15.5%， m/m）， 0.40 g/10 mL NaCl， while the concentration of WPI was 1 mg/mL， at pH 4.0. Under the optimized conditions， αLA was separated to the upper phase while βLG to the bottom phase with the yield of 98.2% and 96.6% respectively.

Keywords Aqueous twophase system； Whey protein isolate； Poly （ethylene glycolranpropylene glycol） monobutyl ether； Separation