佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠血管新生COX—2、PI3K、AKT與細(xì)胞因子相關(guān)性研究

范為民　李艷　俞志超　葉玲梅

【摘要】 目的：觀察佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠環(huán)氧化酶-2（COX-2）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（AKT）的表達(dá)，以及其與白細(xì)胞介素-6（IL-6）、大鼠白細(xì)胞介素-10（IL-10）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）細(xì)胞因子的關(guān)系。方法：將20只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC組）、模型對(duì)照組（MC組），每組10只。MC組每只大鼠右后足趾皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑0.1 ml，復(fù)制佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠模型，NC組每只大鼠右后足趾皮內(nèi)注射蒸餾水0.1 ml，兩組均給藥18 d。結(jié)果：與NC組比較，MC組足腫脹率、關(guān)節(jié)炎指數(shù)均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；MC組的IL-6、VEGF指標(biāo)也均明顯升高，而IL-10指標(biāo)明顯下降升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；MC組的COX-2、PI3K、AKT指標(biāo)均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；MC組大鼠COX-2與IL-6、VEGF呈正相關(guān)，與IL-10呈負(fù)相關(guān)；PI3K與IL-6、VEGF呈正相關(guān)，與IL-10呈負(fù)相關(guān)；AKT與IL-6、VEGF呈正相關(guān)。結(jié)論：COX-2、PI3K、AKT與IL-6、IL-10、VEGF細(xì)胞因子密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎； 環(huán)氧化酶-2； 磷脂酰肌醇3-激酶； 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶； 血管新生

中圖分類(lèi)號(hào) R331.32 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1674-6805（2016）6-0146-02

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2016.6.081

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種以滑膜增生、關(guān)節(jié)破壞為主要特征的自身免疫系統(tǒng)疾病。滑膜炎主要病理表現(xiàn)為炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和血管增生。近些年，研究證實(shí)PI3K/AKT通路參與RA滑膜血管增生病變[1]。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）技術(shù)，檢測(cè)佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠血管新生相關(guān)的COX-2、PI3K、AKT的變化，研究其與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎IL-6、IL-10、VEGF等因子之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠20只，體重（200±20）g，由上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)碼：SCXK（滬）2013-0006。

1.2 藥品及試劑

弗氏完全佐劑（美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)），蒸餾水（弋磯山醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供），IL-6試劑盒、IL-10試劑盒、VEGF試劑盒、COX-2試劑盒、PI3K試劑盒、AKT試劑盒（武漢華美生物工程有限公司提供）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

離心機(jī)（安徽嘉文儀器有限責(zé)任公司），電熱恒溫箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司），洗板機(jī)（雷杜生命科學(xué)股份有限公司），漩渦混合器（其林貝爾儀器制造有限公司），酶標(biāo)儀（雷杜生命科學(xué)股份有限公司）。

1.4 造模方法

將20只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC組），模型對(duì)照組（MC組），每組10只。MC組每只大鼠右后足趾皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑0.1 ml，復(fù)制佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠模型，NC組每只大鼠右后足趾皮內(nèi)注射蒸餾水0.1 ml，兩組均給藥18 d。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 大鼠足腫脹率檢測(cè) 于致炎前、致炎后應(yīng)用排水法分別測(cè)定每只大鼠右后足容積，并計(jì)算出大鼠足腫脹率[腫脹率（%）=（致炎后足容積-致炎前足容積）/致炎前足容積×100%]。

1.5.2 大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)檢測(cè) 于致炎前、致炎后計(jì)算大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)：采用5級(jí)評(píng)分法，四肢關(guān)節(jié)炎指數(shù)之和代表每只大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)，積分越高，關(guān)節(jié)癥狀越嚴(yán)重，最高分值為16分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，關(guān)節(jié)正常無(wú)紅腫；1分，趾關(guān)節(jié)紅腫；2分，趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹；3分，踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4分，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹、關(guān)節(jié)嚴(yán)重變形[2]。

1.5.3 大鼠IL-6、IL-10、VEGF、COX-2、PI3K、AKT指標(biāo)檢測(cè) 于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠腹主動(dòng)脈取血，嚴(yán)格按照試劑盒要求，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)大鼠IL-6、IL-10、VEGF、COX-2、PI3K、AKT指標(biāo)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用多元回歸相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠足腫脹率和關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較

給藥前，兩組大鼠足腫脹率、關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；給藥后，MC組足腫脹率、關(guān)節(jié)炎指數(shù)均明顯高于NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），詳見(jiàn)表1。

2.2 兩組大鼠IL-6、IL-10、VEGF比較

給藥后，MC組的IL-6、VEGF指標(biāo)均明顯高于NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；而IL-10指標(biāo)明顯低于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），詳見(jiàn)表2。

2.3 兩組大鼠COX-2、PI3K、AKT比較

給藥后，與NC組比較，MC組的COX-2、PI3K、AKT指標(biāo)均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），詳見(jiàn)表3。

2.4 MC組大鼠COX-2、PI3K、AKT與IL-6、IL-10、VEGF相關(guān)性分析

MC組大鼠COX-2與IL-6、VEGF呈正相關(guān)，與IL-10呈負(fù)相關(guān)；PI3K與IL-6、VEGF呈正相關(guān)，與IL-10呈負(fù)相關(guān)；AKT與IL-6、VEGF呈正相關(guān)，詳見(jiàn)表4。

3 討論

RA滑膜血管新生是滑膜炎癥的主要病理特點(diǎn)和病理結(jié)果之一，是造成關(guān)節(jié)破壞的重要原因，防治血管新生成為RA治療的主要靶點(diǎn)[3]。

IL-6主要由單核或巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的單核因子，起促炎作用。IL-10主要由T細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子，起抑炎作用。正常情況下，二者的動(dòng)態(tài)平衡是維持機(jī)體正常免疫功能的必要條件。但是當(dāng)IL-6產(chǎn)生過(guò)高，或IL-10產(chǎn)生相對(duì)過(guò)低，機(jī)體正常免疫功能相對(duì)平衡就被打破，機(jī)體就會(huì)出現(xiàn)異常，從而導(dǎo)致RA等免疫性疾病的發(fā)生。VEGF是一種糖基化分泌性多肽因子，作用于滑膜血管內(nèi)皮，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖，增加RA微血管通透性，導(dǎo)致RA血管新生形成和滑膜炎癥、滑膜血管翳程度的加重[4]。因此，IL-6和IL-10動(dòng)態(tài)不平衡及VEGF過(guò)度表達(dá)對(duì)滑膜血管新生及RA病情加重有重要影響。COX-2是環(huán)氧化酶（COX）的亞型，COX-2的選擇性抑制劑可以減輕關(guān)節(jié)炎的新生血管形成[5]。PI3K、AKT是血管生成的重要調(diào)節(jié)因子[6-7]，眾多研究結(jié)果表明，PI3K/AKT信號(hào)通路與RA的滑膜細(xì)胞增殖、血管新生有重要關(guān)系[8-11]。

本研究結(jié)果顯示，MC組足腫脹率、關(guān)節(jié)炎指數(shù)均明顯高于NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；MC組的IL-6、VEGF指標(biāo)明顯升高，而IL-10指標(biāo)明顯下降升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；MC組的COX-2、PI3K、AKT指標(biāo)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；MC組大鼠COX-2與IL-6、VEGF呈正相關(guān)，與IL-10呈負(fù)相關(guān)；PI3K與IL-6、VEGF呈正相關(guān)，與IL-10呈負(fù)相關(guān)；AKT與IL-6、VEGF呈正相關(guān)。研究結(jié)果證實(shí)，血管新生相關(guān)的COX-2、PI3K、AKT與IL-6、IL-10、VEGF細(xì)胞因子有密切相關(guān)。

參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2015-10-09）