生物技術在林木育種中的應用

2016-10-21 16:11:06王德源

吉林農業·下半月 2016年6期

摘要：林木生長周期長，受環境影響大，遺傳雜合性高，增加了常規育種的盲目性。生物技術的發展為林木新品種的培育提供了新的途徑。本文概述了分子標記、基因工程和細胞工程在林木遺傳育種中的應用，以期為相關研究提供參考。

關鍵詞：林木育種；生物技術；分子標記；基因工程；細胞工程

中圖分類號： S722 文獻標識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.12.047

森林是人類的資源寶庫，不僅能夠提供木材、油料、中草藥材等林產品，還帶來巨大的經濟效益，且具有防風固沙、涵養水分、美化環境等生態效益。近年來，環境保護和可持續發展越來越受到人們的重視，對生態環境保護的要求越來越高，而人們對木材的需求量也日漸增加，因此保護現有的森林資源，營造優質人工林顯得尤為重要。但林木常規育種周期長、受環境影響大，增加了育種的盲目性[1]，生物技術的運用可對林木的基因進行相應的改進，讓林木生長的特性發生變化，打破種間雜交不親和的界限，加速林木新品種的培育，有效地提高林木資源的供應[2， 3]。因此依靠生物技術手段與常規育種相結合，縮短育種周期，選育新品種，營造優質人工林，對緩解木材需求和生態環境保護的矛盾具有重要的意義[4]。隨著生物技術的發展，分子標記輔助選擇育種以及基因工程技術手段的應用，為加速林木新品種的選育奠定了基礎[5]。

1 分子標記技術

DNA分子標記（DNA Molecular Marker）通過核苷酸序列的差異直接反映了DNA水平的遺傳多態性，作為新一代的遺傳標記技術，其較傳統的形態標記、生化標記等遺傳標記精度更高、穩定性更好、信息量更大，具有更高的多態性而更能全面的反映遺傳多樣性[6]。近年來，隨著現代分子生物學的不斷發展，DNA分子標記技術也不斷發展更新，目前已廣泛應用于同源性分析、基因定位、遺傳育種等多個方面[7]。

1.1 主要的DNA分子標記技術

隨著各種生物技術的不斷發展，DAN分子標記從最初基于酶切的RFLP標記，到以PCR技術為基礎的RAPD技術，再到酶切和PCR結合的AFLP技術，直至目前基于基因組測序、轉錄組測序、芯片技術的SNP等分子標記。目前，在所有分子標記中，RFLP、AFLP、SSR 和 RAPD 四種分子標記使用較為普遍，被廣泛應用于林業研究中。

基于DNA-DNA雜交的限制性片段長度多態性（Restriction Fragment Length Polymorphisms，RFLP）標記是70年代末發展起來的第一代分子標記，是最早用于遺傳多樣性分析的DNA分子標記技術之一[8]，主要用于標記目的基因的繪制。基于PCR擴增的隨機擴增多態性 DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）標記可以由擴增產物的多態性反映基因組相應區域的多態性，其操作簡單快速、靈敏度高、不受基因組結構的限制且無物種特異性，具有較廣的適用范圍。繼RFLP 之后的第二代分子標記——簡單序列重復（Simple Sequence Repeat，SSR）標記，基于真核生物基因組中存在著的1～4個堿基對組成的簡單重復序列，其具有較豐富的多態性，在遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建等方面均使用廣泛，但尚未開發SSR分子標記的物種開發時費用較高。酶切與PCR技術相結合的AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）標記擴增效率高，多態性、重復性和穩定性都較好，但其操作難度較大，不易實施。

1.2 DNA分子標記技術的應用

由于DNA分子標記技術具有簡便快捷、準確和多態性高、不受組織類別和發育時期限制等優點，該技術被廣泛應用于林木群體遺傳研究[9， 10]。王佳媛等[11]通過SNP分子標記技術初步研究了凹葉木蘭的遺傳多樣性，發現四川南部麻咪澤和美姑大風頂兩個自然保護區內不同居群的凹葉木蘭具有較高遺傳多樣性，為野生凹葉木蘭保護政策的制定提供了依據。歐陽磊等[12]基于杉木基因組分子標記，利用52對SSR引物，對國家級杉木種質資源庫保存的遺傳材料進行遺傳多樣性分析，為種質資源的管理及提高育種效率提供了重要依據。

DNA分子標記也常用于林木親緣關系研究和種質資源鑒定[13]。萬愛華等[14]運用RAPD技術，對湖北京山馬尾松無性系種子園123株優樹針葉的分析表明各群體之間親緣關系的遠近與緯度的相關性明顯，與地理距離的相關性較明顯，而與經度的相關性不明顯，證明了以行政區劃即按省份采集優樹建立馬尾松無性系種子園的方法是可取的。李衛星等[15]采用ISSR分子標記分析42個銀杏雄株的親緣關系，發現雄株的親緣關系與地區分布不完全相關，山東與江蘇的部分銀杏雄株試材親緣關系較近。在林木遺傳改良中，通過分子標記技術對遺傳進化關系進行分析，在分子水平上闡明生物系統演化關系，有利于育種親本的選配和種質資源的合理利用[16]。

分子標記的發展促進了林木分子遺傳圖譜的構建。Nelson等首次利用 RAPD標記構建了包含68個濕地松部分連鎖群的遺傳連鎖圖[16]。目前已有桉樹、鵝掌楸、杜仲及多個松屬樹種構建了遺傳圖譜[16-19]。林木遺傳連鎖圖譜的構建為控制林木重要經濟性狀、抗蟲抗病、耐脅迫等基因的分子標記輔助選擇（marker-assisted selection，MAS）定位奠定了基礎，使早期選擇成為可能。MAS在雜交親本的選配、雜種實生苗的早期鑒定選擇、遺傳轉化中目的基因的檢測、雌雄異株樹木幼苗的性別鑒定、多種抗病性狀同時篩選等方面均有應用[20]。

2基因工程技術

基因工程是現代生物技術的核心，為林木遺傳改良提供了一條新的途徑[4， 21]。將外源目的基因導入目標植物基因組中，使其在新的遺傳背景中產生新的表型性狀。基因工程技術可打破種間雜交不親和的界限，根據人們的意愿去改造林木品種的遺傳特性，創造出新的遺傳變異和育種資源[21]。該技術在大豆、玉米等農作物育種中已經得到了大量的成功應用，但在林木中的應用起步較晚，目前主要在楊樹、桉樹等樹種中研究較為深入，目的基因有抗蟲抗病基因、抗逆基因、材性相關基因、促進開花的基因、生長性狀改良基因、抗環境污染基因等[4]。

2.1抗性相關基因工程

近年來，國內外研究人員已為多種樹種進行了抗蟲抗病、抗除草劑、抗旱、抗鹽和抗寒等方面的基因工程研究，分別獲得幾十個相關抗性的基因，并在楊屬、松屬等林木樹種中獲得了轉基因植株。如將來自水稻的半胱氨酸蛋白酶抑制因子OCI基因轉入楊樹雜種無性系NIRA353-38，提高了它們對節肢動物及病原性害蟲的抗性[22]。歐洲櫟和歐美楊的脫水素基因QrDhn1、QrDhn2、QrDhn3、peudhn1均能夠響應外部缺水條件，具有增強植物脫水耐性的功能[5]。白樺脂肪酸生物合成基因BpFAD3、BpFAD7和BpFAD8能提高白樺抗寒能力。

2.2 材質相關基因工程

利用基因工程手段調控4CL、CAD、C3H、MYB、CCR、COMT、CCoAOMT等基因，進而調控木質素和纖維素的合成，降低紙漿材的木質素含量，可提高紙漿得率，減少能耗，改善環境。MYB轉錄因子PtrMYB3、Ptr-MYB20及NAC轉錄因子PtrWND2B、PtrWND6B均被證實參與纖維素和木質素的生物合成，參與調控木材形成[5]。

2.3生殖相關基因工程

林木生長周期長，限制了林木育種及遺傳改良進程，通過基因工程手段可促進林木提早開花縮短育種周期。如一般的野生型楊樹需8～20 年才能開花，而轉LFY基因的楊樹僅5個月就可開花[4]。利用基因工程手段還可以培育不育的轉基因林木新品種而有效減少轉基因花粉引起的基因逃逸，如王冬梅等對PtAP3基因正反義表達載體進行研究，以期干擾開花使毛白楊等樹種花器官敗育而控制飛絮污染。

2.4生長性狀改良基因工程

通過基因工程技術可調節樹木內源激素平衡、改良林木生長性狀。有研究表明，轉入rolA、B、C基因的植物，促進根的形成和發育的同時可促進植株地上部分的生長、發育，轉入 rolC 基因的雜種楊樹表現出頂端優勢降低、節間縮短、植株矮化，這對林木種子園的管理具有重要意義。

3細胞工程技術

植物細胞具有全能性，在適宜條件下，一個植物細胞可形成一個完整的植株[23]。林木細胞工程基于全能性，對不同組織、細胞進行細胞雜交等各種遺傳操作，改變細胞的遺傳基礎，加速個體繁殖，選育優良品種或新品種。隨著對優良造林苗木需求及瀕危植物保護任務的增加，細胞工程技術在林木快速繁殖、種植資源保護、新品種選育等方面也具有重要作用。目前在原生質體培養、體細胞胚胎發生、植株再生、人工種子、細胞雜交和體細胞突變體的篩選與利用等方面已取得了令人矚目的進展[22]，已成功應用于香椿、梨、蘋果等50多種經濟林木。

3.1體細胞胚胎發生和人工種子

體細胞胚再生容易，繁殖效率高，同時后代具有較好的穩定性，是人工種子和轉基因良好材料。馬尾松、楊樹等30多種木本植物已經獲得了體胚。華山松、核桃、挪威云杉、杉木、雜交鵝掌楸等樹種已經通過體胚發生獲得再生植株。近年來，南京林業大學施季森教授團隊與多家單位合作，累計生產交鵝掌楸體胚苗900 多萬株，杉木優良無性系組織培養和體胚培養苗木6000 多萬株。桑樹、云杉、桉樹等木本植物已成功利用體胚制成了人工種子。

3.2原生質體培養及體細胞雜交

原生質體已成功用于體細胞雜交、原生質體轉化、外源基因導入等。目前，部分楊屬、松屬及北美鵝掌揪、桉樹等木本植物已利用原生質體培養獲得了再生植株。體細胞雜交通過細胞的融合產生雜種，不經有性過程，克服了遠源雜交不親和的問題，為新品種的培育提供了一個新的途徑。

4結語

近年來，生物技術已廣泛應用于林木種質資源和遺傳改良研究領域。目前，利用基因工程技術獲得了林木速生優質、抗蟲、抗病、抗寒、抗旱、耐鹽等新種質；利用DNA分子標記構建了多種林木樹種的遺傳圖譜并定位到一些重要性狀的基因。然而，與農作物相比，林木育種在分子生物學技術研究與應用方面還較為落后，還存在許多問題有待研究，如應注重轉基因林木的田間試驗與穩定性和安全性評價。雖然生物技術在林木遺傳改良的研究和實際應用過程中還存在著一些問題[24]，但隨著相關科學理論及技術手段的不斷發展和完善，相信在不久的將來它將在林業自然資源保存、林木育種效率的提高及林木種質創新等領域起到關鍵作用。

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