冰凍切片的制作體會

顧科峰 張憲 王新 湯寅

摘要：目的 ：探討在冰凍切片過程中針對不同組織樣本采取的相應對策，以達到最佳的切片效果。方法： 回顧分析我院自2011年以來148例術中快速冰凍切片的制作方法。針對不同的組織樣本，選擇的冰凍溫度與時間不同，包埋與切片的也方法不同。結果： 切片厚薄均勻完整，無皺褶，核染色清晰，細胞形態完整，核漿對比鮮明。結論： 冰凍溫度與時間、組織包埋、切片方法等是制作高質量冰凍切片的關鍵。

關鍵詞：冰凍切片；樣本；制作；效果

術中快速冰凍切片檢查是病理科的一項常規工作，但同時又是一項非常重要和高風險的檢查。它是在低溫情況下將新鮮組織冷凍到一定硬度，然后再進行切片的一種方法【1】。它能對臨床治療提供積極的指導意義，為手術醫生決定手術方式和范圍提供依據。而高質量的冰凍切片又是這項檢查的首要條件。所以，能否制作一張優質的冰凍切片就顯得尤為重要。我科自2011年引進英國珊頓冰凍切片機以來，我共完成制作冰凍切片148例。

1 材料與方法

1.1材料

臨床送檢的各類手術中新鮮組織，不加任何固定液，直接送至病理科。其中甲狀腺25例、子宮腫瘤24例、卵巢腫瘤22例、乳腺腫瘤51例、肺腫瘤4例、胃腸道腫瘤5例、其它17例。

1.2方法

采用手術切除后新鮮標本，取一塊1.5*1.5*0.3cm左右【2】的有病變組織塊，去除多余的脂肪組織、鈣化物、壞死組織和骨組織。取材速度要快，避免取材器械和取材臺上有水接觸，用干紗布把組織上的血液和液體吸干，避免冰凍切片出現過多的冰晶現象【3】。然后直接放在冷凍托盤上，滴加OCT（聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物）或普通膠水。根據要切片的組織類型設定冰凍溫度和冰凍時間。切片厚度以5微米為佳，然后迅速粘片，投入AF液（40%甲醛與95%酒精1：4的混合液）中固定1min左右。蘇木素染色，水洗，分化，返藍，伊紅，梯度酒精（從低濃度到高濃度）脫水，透明，封固。

2. 結果

切片質量較好，厚薄均勻完整，無皺褶，核染色清晰，細胞形態完整，核漿對比明顯，符合冰凍診斷要求。

3 討論

隨著現代臨床外科技術的突飛猛進對術中快速冰凍切片的要求越來越高，病例也越來越多，送檢的組織也是千差萬別。快速、高質量的冰凍切片是確保術中診斷科學性和可靠性的重要保證【4】。這就要求病理科的醫生和技術員具有過硬的技術，能在短時間內拿出令人滿意的結果。因此我總結了一些在平時制片過程中對于溫度與時間、包埋、切片的經驗和體會，與大家共鑒。

3.1溫度與時間

冰凍切片機的箱體應24h處于待機狀態，我們平時一般設定在-25℃。溫度過低時，組織變為酥脆，切片時容易破碎甚至粉末狀。溫度過高時，組織呈粘稠狀，切片易卷曲甚至切不成片。因根據所需冰凍組織類型分別對待。作者經驗甲狀腺、淋巴結、肝、脾、腎等最佳溫度控制在-20℃左右，冷凍1～2min。子宮、乳腺、胃腸等溫度控制在-25℃左右，冷凍2min左右。含脂肪多的組織、軟組織等溫度控制在-30℃左右，冷凍3min以上。當然機器的新舊和環境溫度的變化等也會帶來一定的影響，應酌情對待。

3.2包埋

選擇合適的包埋劑，現在常用的包埋劑是OCT，但也有單位用的是普通的膠水，作者單位使用膠水包埋效果很好，而且有資料也報道膠水與OCT有相識的物理特性【5】，可以替代OCT，節省成本。這就要求在包埋時要先冷凍膠水，等膠水快凝固時再加入組織塊，可以防止組織因吸水而使細胞中有冰晶出現。對于小組織，我們要求先用適量包埋劑在標本托上做一個膠水的底托，然后把小組織根據切面放好，再滴加少量包埋劑在組織上，迅速冷凍。對于像囊壁樣的長條組織，可以像卷紙一樣，把組織盤起來，垂直放在標本托上，使囊壁的層次分明，利于切片和鏡檢。包埋時要根據組織的大小，選擇大、中、小合適的標本托，組織塊要包埋平整，盡量放在冷凍托的中央位置。總之，包埋的重要性和技術要領是每個技術員都必須心領神會的。

3.3切片

當冷凍包埋劑發白變硬后，就可以開始切片了，更換鋒利的刀片，清潔防卷板和調整防卷板與切片刀的角度（作者的經驗一般為5度），防止切片卷縮。切片時用力均勻，厚度5微米，過薄易造成組織皺縮和鏡下核細胞碎裂【6】，過厚容易造成組織掉片。如遇到帶有脂肪組織的或軟組織等難以切片的，可以用冷凍錘再次冷凍組織延長冷凍時間或增加冷凍切片厚度到6-8微米。盡量修面暴露組織至最大面，有包膜的一定要切完整，小結節或重要病變部位要切到位，必要時可多切幾個面【7】，防止因為沒切到位而發生漏診，也可以多粘幾張玻片以便挑選備用。粘片時玻片要干凈，防止掉片，容易掉片的組織可以使用涂膠片，動作要快，避免因動作慢而使切片有皺褶，粘不上片等情況發生。切片時還要注意組織的包埋方向，切片方向由易到難，由粘膜面向漿膜面，必要時可以轉動冷凍的標本托，以利于制片。對于冷凍時間過長而使組織變脆的，可以用帶乳膠手套的手指輕觸組織，使其稍稍回溫。

中華醫學會中規定完成冰凍HE染色切片制備通常時間為20～25min【8】，在如此短的時間內拿出一張完美的冰凍切片，不僅要求技術員有精湛的技術，還要有高度的責任心和精益求精的態度。細節決定成敗，多注意制片過程中的各個環節和不同組織成分的特性。理論聯系實際，認真仔細的解決遇到的各種問題，在不斷摸索中總結和改進，才能保證冰凍切片的完整、優良。

參考文獻：

[1] 王伯云，李玉松，黃高升，等。病理學技術[M].北京：人民衛生出版社，2000：88-89.

[2] Bancroft JD.組織學技術的理論與實踐[M].6版.北京：北京大學醫學出版社，2010：86.

[3] 許平.快速冰凍切片制備方法的改進[J].鄭州大學學報（醫學版），2010，3（2）：241.

[4] 邴魯軍，高英茂，郭雨霽，等.冰凍切片常遇到的問題及解決對策[J].醫學信息，2006，19（9）：1631-1633.

[5] 高艷.冰凍切片的制作方法討論[J].云南醫藥，2005，26（4）：363-364.

[6] 王永軍，王珩，劉世正，等.不同組織冰凍切片的體會[J].臨床與病理學雜志，2010，26（1）：114.

[7] 崔京淑.冰凍切片的制作及常見問題對策[J].吉林醫學，2009，30（17）：120.

[8] 中華醫學會.臨床技術操作規范，病理學分冊[M].京：人民軍醫出版社，2004：10-11.