太赫茲波段超材料在核酸恒溫指數擴增檢測上的應用*

李永川，王思江，毛洪艷，顏識涵，劉毅，魏東山，夏良平*，黃慶*

（1.第三軍醫大學西南醫院檢驗科，重慶400038；2.中國科學院重慶綠色智能技術研究院，跨尺度制造技術重慶市重點實驗室，重慶400714）

太赫茲波段超材料在核酸恒溫指數擴增檢測上的應用*

李永川1，王思江2，毛洪艷2，顏識涵2，劉毅2，魏東山2，夏良平2*，黃慶1*

（1.第三軍醫大學西南醫院檢驗科，重慶400038；2.中國科學院重慶綠色智能技術研究院，跨尺度制造技術重慶市重點實驗室，重慶400714）

超材料對電磁場具有介電環境敏感和局域電場增強等奇特的電磁特性，近年來廣泛用于無標記生物檢測。文中設計并制作了一種金屬開口諧振環陣列結構的超材料，在太赫茲波段下分別檢測核酸恒溫指數擴增前后反應體系，在氮氣干燥環境下，擴增反應前后的頻率偏移量分別為Δf1=（54±3）GHz、Δf2=（60±5）GHz。實驗結果顯示金屬開口諧振環陣列結構的超材料可以作為一種生物傳感器快速無標記檢測核酸擴增前后的變化。

太赫茲；超材料；金屬開口諧振環陣列

EEACC：7230doi：10.3969/j.issn.1004-1699.2016.09.007

太赫茲THz（Terahertz）波是指頻率為0.1 THz～10 THz的電磁波，它具有獨特的優點：能量低，不會對生物大分子產生破壞作用［1］；相干性，可通過獲得THz的相位和幅度變化，得到生物大分子的吸收系數和折射率［2］；指紋譜特性，生物大分子的內/間的弱相互作用力和骨架振動等正好位于THz頻譜范圍［3］。因此，近年來，THz技術在生物醫學檢測領域的研究越發受到重視。但由于目前THz生物檢測技術的靈敏度較低，不能有效檢測微量的生物大分子，因此，發展一種操作簡便、可進行高靈敏THz生物檢測的通用手段逐漸成為大家研究的焦點。

超材料MMs（Metamaterials）主要是由周期性排列的亞波長諧振單元和載體構成的人工復合電磁材料［4］，它具有奇異的電磁諧振特性，如異常透射［5］、局域電場增強［6］、介電環境敏感［7］等特性。在入射THz波的作用下，通過超材料的局域場增強特性，可增強超材料與生物分子之間的相互作用，籍此可提高THz生物檢測的靈敏度。如Hee-Jo Lee等［8］設計的雙環金屬開口諧振環DSRRs（Double Split-ring Resonators）共振頻率為12.35 GHz，能夠分辨出單鏈DNA與互補鏈雜交后的前后變化。Wu Xiaojun等［9］設計了一種簡單的矩形單開口SRRs，利用0.4 THz和1.2 THz的兩個共振頻率頻率偏移量的組合，檢測了不同濃度的鏈霉親和素。

恒溫指數擴增反應EXPAR（Isothermal Expo?nential Amplification Reaction）是近幾年發展的一種核酸擴增反應。它在DNA聚合酶和切口酶作用下，反復進行“切割-延伸-鏈置換”，等溫條件下即可快速對短鏈DNA（8-16堿基）進行指數擴增［10］，一般能夠在10 min之內對靶目標DNA擴增到106倍～109倍［11］，從而能夠從溶液中眾多生物大分子中選擇性極端放大靶DNA，間接提高THz技術在生物大分子檢測應用的靈敏性。

本論文提出了一種幾何結構為五環矩形金屬開口的THz超材料生物傳感器FSRRs（Five Split-ring Resonators），利用光刻工藝制作出了大面積的、結構均一性良好的傳感器件。以核酸恒溫指數擴增反應前后的反應體系為測試對象進行傳感實驗測試發現，相對于FSRRs本身的THz共振透射譜而言，擴增反應前體系的THz譜向低頻移動了Δf1=（54±3）GHz，而擴增反應后體系的THz譜向低頻移動了Δf2=（60±5）GHz的頻移，取得了較高靈敏度的探測結果。

1　主要試劑和材料

VentR（exo-）DNA聚合酶、Nt.BstNBI內切酶、10×Thermopol反應緩沖液、10×NEBuffer 3.1緩沖液等以上試劑均購自美國New England Biolabs（NEB）公司；20×Evagreen熒光染料購自美國Biotium公司；滅菌雙蒸水ddH2O購自北京鼎國昌盛生物公司；dNTPs購自美國Promega公司；引物Trigger和模板Template均購自上海生工公司；Secure-Seal?Adhesive Spacers墊片（美國Molecular Probes公司）；Tray-5000太赫茲時域光譜儀（Advanced Photonix Inc，美國API公司）。

1.1FSRRs結構的制備及表征

超材料的諧振頻率與其結構和尺寸相關，文中所設計的FSRRs結構如圖1（a）所示，襯底為硅，金屬結構所選材料為金。應用光刻工藝制作FSRRs結構，制作流程為①鍍膜：在潔凈的硅表面蒸鍍厚150 nm的金膜。②涂膠：將S1805正膠均勻旋涂在金膜表面，前烘、冷卻。③曝光：采用URE-2 000A/55移動掩模曝光系統，在均勻涂膠的表面進行接觸式定時曝光，然后顯影。④濕法刻蝕：使用碘∶碘化鉀∶水=6 g∶20 g∶100 mL的混合液，刻蝕金膜，之后用去大量離子水沖洗。⑤去膠：無水乙醇去除光刻膠，即可獲得FSRRs結構。

圖1　SRRs結構

經以上光刻工藝流程，制備得到的FSRRs如圖1（b）所示。這一結果為10×偏光顯微鏡下的光學顯微圖像，可見該FSRRs是大面積均一的，這為它在THz生物檢測中可重復利用提供了保障。該結構的細節放大圖，如圖1（b）中插圖所示，為50×顯微鏡下的顯微圖像。結果表明，所制備的FSRRs的棱角分明，對應各金屬環的形狀、大小一致，結構參數如圖1（a）所示：襯底硅的厚度h=500μm，金屬環最外的邊長l=48 μm，開口寬度g=2.5 μm，結構單元內的環與環之間距離p= 2 μm，結構單元之間的間距w=10 μm，金膜的厚度150 nm。

1.2核酸恒溫指數擴增反應體系

核酸序列詳細信息具體見表1。

表1　核酸序列

核酸擴增每管反應體系中各反應物質濃度為0.05 U/μL VentR（exo-）DNA聚合酶，0.05 U/μL Nt.BstNBI內切酶，400 μmol/L dNTPs，1×Thermopol反應緩沖液，0.5×NEBuffer 3.1緩沖液，1×Evagreen熒光染料，1pmol/L引物序列（Trigger），100 nmol/L模板序列（Tempalte），加入ddH2O使反應體系總體積至20 μL，60℃放入熒光定量PCR儀反應。

2　結果

在完成了FSRRs結構的制備后，下面將對其傳感性能進行實驗測試，所選取的測試對象為核酸恒溫指數擴增反應前后的體系。采用太赫茲時域光譜系統（THz-TDS）TRay-5000，在透射模式下進行實驗。在測量過程中，為減少空氣中水對太赫茲波的吸收干擾，須將整個裝置置于通入氮氣流的玻璃箱中。在濕度低于2%，溫度為（21.02±0.01）℃的環境下進行實驗測試。

檢測樣品前，在FSRRs表面粘貼一空白區域為直徑15 mm、厚度100 μm的墊片，THz波下檢測并獲得未放入樣品前充滿氮氣環境的參考信號IReference和THz波透過潔凈的FSRRs表面獲得的信號IBare。測試核酸擴增反應前后方法為：在制備完成的SRRs表面上空白圓形區域，分別滴入核酸擴增前或擴增后的樣品溶液8 μL和ddH2O 22 μL，然后輕微搖勻使混合液均勻分布在空白的圓形區域，50℃烘干后分別檢測，得到透射譜結果為IPre-amplification和IAfteramplification。FSRRs、核酸擴增反應前體系和反應后體系歸一化透過率分別為

將檢測獲得的數據經過歸一化處理后獲得的透過率結果如圖2所示。未加入樣品前，超材料結構的諧振頻率處位于1.33 THz處。分別加入核酸擴增前溶液和核酸擴增后溶液并進行烘干后，經多次重復實驗發現：與超材料結構本身的THz透射譜相比，核酸擴增前的溶液的THz透射譜向低頻偏移了（54±3）GHz，而擴增后則為（60±5）GHz。可見，所制備得到的超材料結構對核酸恒溫指數擴增的反應前后的差異具有較高的靈敏度，適用于THz生物檢測。

圖2　恒溫核酸指數擴增反應前后的檢測結果

3　討論

所制備的FSRRs結構在入射THz波的驅動下，可等效為一電容-電感LC（Inductor-Capacitor）回路，它的開口處可等效為電容器，其余金屬環部分可等效為電感，其共振頻率為［12］

式中，Leq為等效電感，主要為FSRRs的結構參數決定；Ceq為等效電容，與FSRRs結構周圍的媒質的介電常數有關。將待測物質加入到FSRRs結構表面時，其周圍環境的介電常數將會增大，從而導致Ceq減小，最終引起體系的共振頻率f向低頻移動。根據O’Hara J F的理論［13］，諧振環陣列結構的整體電容

式中，C1為硅基底的電容，C2為硅基底與金屬陣列結構之間的電容，C3為金屬陣列結構的電容，C4為金屬陣列與待測物質間的電容，C5為待測物質的電容。由于文中檢測核酸擴增前后使用的FSRRs結構相同，故待測物質電容C5的改變是引起共振頻率偏移量不同的原因。待測物質電容C5是指FSRRs結構上滴加的溶液中各個組成成分在烘干后的電容C值之和。而EXPAR本質上是將反應溶液中大量游離的dNTPs合成多核苷酸鏈，溶液中使用的酶、蛋白質、鹽離子等在擴增前后的量幾乎不會有變化，烘干后，這些物質的在FSRRs結構單元上產生的電容C幾乎相同，所以擴增前溶液體系中游離的dNTPs和擴增后溶液體系中的多核苷酸鏈的C值不同導致了待測物質電容C5的不同，從而引起反應體系前后THz透射譜的頻移量不同。

超材料可作為一種生物傳感器應用于THz生物檢測，得益于許多生物大分子的集體振蕩模式位于THz波段。如果將具有奇異電磁諧振特性的超材料和生物大分子進行特異性結合，將會有效提高傳感器的靈敏度。另外THz技術尚未突破THz對水敏感性的限制，生物醫學樣本中液態水和檢測環境中的水蒸氣會導致嚴重的THz波水吸收干擾，結果通常是在干燥狀態下進行測量。然而，許多生物大分子只有在水溶液環境中才有生物活性，導致THz波段下超材料生物傳感器在生物醫學上實際應用遇到了瓶頸，這促使我們應著重加強研究THz技術在水相環境中的應用。

本文結合THz波的快速、無標記和超材料的高靈敏度檢測的優勢，利用THz-TDS檢測并得到了核酸恒溫指數擴增反應前后體系的共振頻率偏移量。相較于FSRRs結構本身而言，由于核酸擴增前后反應體系的等效電容Ceq不同，導致反應前后體系的頻率偏移量分別為（54±3）GHz、（60±5）GHz。可見，THz波段超材料可作為一種高靈敏度生物傳感器應用于核酸擴增檢測。但是基于生物醫學實際需求，還需進一步研究THz水敏感性的問題，隨著THz技術的發展和超材料微結構加工技術的提高，THz波段下超材料生物傳感器將會得到更廣泛的應用。

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李永川（1989-），男，在讀碩士，2013年畢業于四川大學，獲得醫學學士學位，現就讀于第三軍醫大學攻讀碩士，主要從事于太赫茲波在生物大分子的應用研究，yongchuanli511@163.com；

夏良平（1986-），男，博士，重慶中科院綠色智能技術研究院助理研究員，主要從事微納光學理論、微納加工工藝與器件、金屬表面等離子體、亞波長金屬結構以及在生物傳感方面的應用研究；

黃慶（1972-），男，博士，第三軍醫大學西南醫院檢驗科副主任、教授、主任醫師、博士生導師；兼任西南大學碩士生導師，主要從事分子診斷學方面研究。

Detection of Isothermal Exponential Amplification Reaction Using Terahertz Metamaterials*

LI Yongchuan1，WANG Sijiang2，MAO Hongyan2，YAN Shihan2，LIU Yi2，WEI Dongshan2，XIA Liangping2*，HUANG Qing1*
（1.Department of Medical Laboratory，Southwest Hospital of the Third Military Medical University，Chongqing 400038，China；2.Research Center for Terahertz Technology，Key Laboratory of Multi-scale Manufacturing Technology，Chongqing Institute of Green and Intelligent Technology，Chongqing 400714，China）

Metamaterial has a dielectric environmentally sensitive and local electric-field enhancement in electro?magnetic field，It was widely used in label-free biodetection in recent years.We designed and fabricated a metama?terial structure assembled by split ring resonator.Before and after the isothermal exponential amplification reaction system were detected at the terahertz band.In dry nitrogen gas environment，the resonance frequency offset were Δf1=（54±3）GHz and Δf2=（60±5）GHz at before and after reaction.The experimental result show that the metamateri?al assembled by split ring resonator can be used as a biosensor for rapid label-free detection in changes of before and after nucleic acid amplification.

terahertz；metamaterials；split ring resonators

O456

A

1004-1699（2016）09-1341-04

項目來源：國家重點基礎研究發展計劃項目（2015CB755400；2015CB755402）；國家自然科學基金重點項目（81430054）；物理與生物醫學交叉實驗室孵化基金項目（WSS-2012～501）

2015-12-24修改日期：2016-05-03