彩葉植物紅葉石楠離體再生體系的研究*

劉柏玲　李守潔　張　凱　彭向永　周　潔　穆雨佳　褚慶文　郭　素　王康滿　邱念偉**（.曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東　曲阜　7365；.山東泰安林業(yè)局徂徠山林場，泰安　7000）

彩葉植物紅葉石楠離體再生體系的研究*

劉柏玲1李守潔1張凱2彭向永1周潔1穆雨佳1褚慶文1郭素1王康滿1邱念偉1**
（1.曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東曲阜273165；2.山東泰安林業(yè)局徂徠山林場，泰安271000）

選取紅葉石楠幼莖和頂芽為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA和NAA激素進(jìn)行離體培養(yǎng)，比較各種激素組合對紅葉石楠初代培養(yǎng)、不定芽分化、生根培養(yǎng)的作用和影響。結(jié)果表明：初代培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為MS+1.5mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA；誘導(dǎo)不定芽分化的最適培養(yǎng)基為MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，誘導(dǎo)率達(dá)到86.7%；生根的最佳培養(yǎng)基為1/2mS+3.0mg/L NAA，生根率達(dá)到92.7%；組培苗移栽成活率為94.6%。

紅葉石楠；分化率；生根率；不定芽

紅葉石楠（Photiniaserdatacv‘hongye’）屬薔薇科石楠屬，是石楠（Photiniaserdata）的栽培變種，為常綠灌木或小喬木，其新梢嫩葉四季呈艷麗似火的紅色而被譽(yù)為“紅葉綠籬”之王，具有很高的觀賞價值［1-3］。紅葉石楠的生長速度快，且萌芽性強(qiáng)，耐修剪，可根據(jù)觀賞需要修剪成不同的樹形，是用途廣泛的喬、灌兼用型高檔彩色樹種［4，5］。在生產(chǎn)應(yīng)用中，紅葉石楠的繁殖方式主要以扦插和壓條為主，但受季節(jié)限制，生長速度慢［6］。為了提高紅葉石楠的繁殖速度，充分利用其觀賞價值，本試驗在前人研究的基礎(chǔ)上［7-11］，以紅葉石楠的幼莖和頂芽為外植體，MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)計6-BA和NAA不同激素濃度組合，先誘導(dǎo)外植體形成腋芽，再誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的不定芽和粗壯的根，獲得可以移栽的組培苗，從而建立紅葉石楠的無性繁殖體系，以解決其扦插繁殖速度慢、成活率低、受季節(jié)限制等問題。

1　材料與方法

1.1實驗材料

材料于2015年3月中旬采自于曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院東側(cè)，選取當(dāng)年新生紅葉石楠幼嫩頂芽和莖段，經(jīng)過消毒處理，備用。

1.2實驗方法

1.2.1材料消毒

取紅葉石楠當(dāng)年新生的頂芽和莖段，去除托葉和葉片，留少量葉柄，取適量洗衣粉或洗潔精浸泡并清洗后，流水緩慢沖洗30min；取出沖洗好的材料在超凈工作臺中用70%乙醇浸泡30s后，用無菌水清洗1～3次；再用0.1%升汞消毒1min，并不斷搖勻，使其消毒充分；最后用無菌水清洗3～5次，每次1～2min，將清洗好的材料放在濾紙上吸干水分，然后切成1.0cm左右莖段，備用。

1.2.2初代培養(yǎng)

經(jīng)消毒的外植體接種到初代培養(yǎng)基中（表1），30天后統(tǒng)計腋芽誘導(dǎo)率和生長狀況，誘導(dǎo)率=（產(chǎn)生腋芽的莖段數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%，比較不同6-BA和NAA組合對腋芽形成的影響。試驗中每處理培養(yǎng)10瓶，每瓶3個外植體，重復(fù)3次，實驗結(jié)果為3次重復(fù)的平均值（下同）。

1.2.3不定芽分化

把初代培養(yǎng)過程中誘導(dǎo)出的腋芽切下，接種到誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中（表2），30天后統(tǒng)計不定芽誘導(dǎo)率和生長狀況，誘導(dǎo)率=（分化不定芽的腋芽/接種總腋芽數(shù)）×100%。

1.2.4生根培養(yǎng)

將繼代培養(yǎng)獲得的不定芽（約3cm）切下，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中（表3），45天后統(tǒng)計生根率、根數(shù)量和根長，生根率=（生根不定芽數(shù)/接種不定芽總數(shù)）×100%。

1.2.5培養(yǎng)方法

本研究以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別添加3%的蔗糖，0.7%的瓊脂，pH值用1m的NaOH調(diào)至5.8～6.0，高壓滅菌（1.1mpa，121℃）20min。接種后置于培養(yǎng)溫度為（25±1）℃、光照強(qiáng)度為1 500～2 000 lx的組培室中進(jìn)行培養(yǎng)，每天光照12 h。

1.2.6馴化移栽

將生根的組培苗瓶蓋打開，加入適量無菌水于培養(yǎng)室中煉苗3天，取出洗凈殘留在小苗根部的培養(yǎng)基，移植于花卉培養(yǎng)土中。先在培養(yǎng)室中培養(yǎng)一段時間，待小苗生長良好后，移出室外，注意適當(dāng)遮蔭保濕。

1.2.7數(shù)據(jù)分析

利用Spss17.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行方差分析和Duncan檢驗。

2　結(jié)果與分析

2.16-BA對紅葉石楠初代培養(yǎng)的影響

為了誘導(dǎo)莖段更快的長出腋芽，在MS培養(yǎng)基中添加0.05mg/L NAA和不同濃度的6-BA（表1），比較各種組合對紅葉石楠腋芽誘導(dǎo)的影響和作用。結(jié)果表明：外植體在3種不同濃度的培養(yǎng)基上均能誘導(dǎo)產(chǎn)生腋芽，但在MS+1.5mg/L 6-BA+ 0.05mg/L NAA培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)率最高，達(dá)86.7%，平均芽長為0.89cm，且葉片顏色為深綠或翠綠，長勢良好。

2.26-BA和NAA對紅葉石楠不定芽分化的影響

為了獲得更多的組培苗，將初代培養(yǎng)得到的腋芽接種到分化培養(yǎng)基中（表2），使腋芽基部形成愈傷組織，再分化出大量不定芽，30天后統(tǒng)計組培苗的生長狀況和分化率，從而分析不同6-BA和NAA組合對不定芽形成的影響。結(jié)果表明：在9種不同激素濃度組合的培養(yǎng)中，當(dāng)6-BA濃度一定時，隨著NAA濃度的增加，組培苗更粗壯，但其不定芽誘導(dǎo)率會有所下降。在MS+2.0mg/L 6-BA+ 0.2mg/L NAA的培養(yǎng)基中能分化出大量不定芽，誘導(dǎo)率達(dá)到98.3%，苗高為2.67cm。試管苗的葉片翠綠，葉邊緣發(fā)紅，苗粗壯且高。

2.3生根培養(yǎng)

將長勢良好的組培苗切下，在1/2MS培養(yǎng)基中添加有不同濃度的NAA和IBA進(jìn)行生根（表3），45天后統(tǒng)計生根情況。結(jié)果表明：培養(yǎng)時間相同時，NAA較IBA（結(jié)果未顯示）具有更好的生根效果，當(dāng)培養(yǎng)基為1/2MS+3.0mg/L NAA時，生根率達(dá)到92.7%，根為紅色，數(shù)量多且粗壯。

表1　6-BA和NAA對紅葉石楠初代培養(yǎng)的影響

表2　6-BA和NAA對紅葉石楠生長狀況的影響

表3　不同濃度的NAA對紅葉石楠生根的影響

2.4移栽

選取生有良好根系的粗壯組培苗進(jìn)行移栽，先在組培室中開蓋馴化3天，取出小苗洗去根部殘留的培養(yǎng)基，移栽到盛有培養(yǎng)土的容器中，成活率達(dá)到94.6%。植株生長茂盛，在次年春季長出新的枝條，說明紅葉石楠是一種較易移栽成活的植物。

3　討　論

3.1本試驗中，在初春紅葉石楠剛開始長出幼莖和頂芽時采集外植體，此時外植體尚未進(jìn)行次生生長，用0.1%的HgCl2溶液處理1min即可達(dá)到殺菌消毒的目的，短時間消毒處理能減少對外植體的傷害從而更快地誘導(dǎo)出腋芽。并且腋芽長勢良好，試管苗粗壯，這與幼嫩莖段內(nèi)不含毒素，更利于脫分化有關(guān)，因此，在園藝植物組培生產(chǎn)時大多利用植物的莖尖作為外植體［12-14］。在處理外植體時，剪去葉片后，需要保留少量的葉柄，待消毒處理后用刀片切去外植體與消毒試劑接觸的地方，否則會因為局部褐化而導(dǎo)致整個外植體死亡，這與鄒永梅在費(fèi)氏石楠的組織培養(yǎng)研究中結(jié)論相同［15］。

3.2在許多植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基中需要添加植物激素，細(xì)胞分裂素（如6-BA）是一種最重要的影響細(xì)胞分裂和不定芽形成的植物激素［16，17］，并且在多種植物培養(yǎng)中，在合適的細(xì)胞分裂素中添加低濃度的生長素（如NAA）可以促進(jìn)不定芽的形成［18，19］。本試驗在誘導(dǎo)腋芽形成時添加0.05mg/L NAA［20］和不同濃度的6-BA，在6-BA濃度為1.5mg/L時，誘導(dǎo)率最高達(dá)86.7%。在誘導(dǎo)腋芽分化不定芽過程中，添加不同濃度的植物激素6-BA 和NAA均能誘導(dǎo)分化出不定芽，結(jié)果顯示不定芽的誘導(dǎo)率與某種激素的濃度并無相關(guān)性，而與6-BA和NAA的比值相關(guān)。當(dāng)培養(yǎng)基濃度為MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，即6-BA/NAA 為10時利于紅葉石楠產(chǎn)生大量叢生芽，此結(jié)果與前人研究結(jié)論相似，即當(dāng)6-BA/NAA比值高時，有利于不定芽的分化，而比值低時有利于不定根的形成［21-23］。在紅葉石楠生根培養(yǎng)過程中，隨著NAA濃度的提高，生根率越高，當(dāng)NAA為3.0mg/L時，生根率達(dá)92.7%。并且，紅葉石楠在MS培養(yǎng)基中生長的小苗在較長時間里也能形成細(xì)小根系，說明紅葉石楠進(jìn)行扦插或壓條繁殖也是可行的。

3.3本試驗以紅葉石楠的幼嫩莖段為外植體，經(jīng)過組織培養(yǎng)的過程，建立了完整的無性繁殖體系，得到了生長良好的植株，為紅葉石楠的種植資源利用提供了技術(shù)保證，從而可以充分利用這一具有較高觀賞價值的彩葉植物。

［1］李法曾，張衛(wèi)東，張學(xué)杰.泰山植物志（上卷）［M］.濟(jì)南：山東科學(xué)技術(shù)出版社，2012.

［2］杜建會，魏興琥.園林紅葉植物新貴-紅葉石楠［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（11）：5263-5265.

［3］孔祥海，李思，丁力，等.紅葉石楠葉片發(fā)育的形態(tài)特征及色素含量變化［J］.北方園藝，2015（24）：51-55.

［4］蘆建國，連洪燕.紅葉石楠在園林中的應(yīng)用［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2007（1）：40-41.

［5］孫海偉，劉靜，宋健，等.轉(zhuǎn)AmGS基因紅葉石楠的分子檢測及抗寒性分析［J］.林業(yè)科學(xué)，2012，48（7）：30-38.

［6］黃新，富裕藍(lán)，楊海燕，等.石楠的組織培養(yǎng)研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，32（26）：1166.

［7］鄧小梅，黃敏仁，王明庥.紅葉石楠“紅羅賓”的組培高效再生系統(tǒng)的建立［J］.江西林業(yè)科技，2004（4）：19-21.

［8］黃美娟，鄧小梅，符樹根，等.紅葉石楠“紅羅賓”組培快繁技術(shù)研究［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，25（4）：604-607.

［9］何蔚葒，馬杰，崔波，等.紅葉石楠的組織培養(yǎng)技術(shù)研究［J］.河南科學(xué)，2004，22（5）：646-647.

［10］梅忠，方勇.紅葉石楠組織培養(yǎng)技術(shù)的研究［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，21（6）：43-45.

［11］楊雪，吳國盛，張雯雯，等.紅葉石楠組織培養(yǎng)技術(shù)比較研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（16）：7337-7340.

［12］李昌禹，郭太君，焦培娟，等.唐菖蒲組培脫毒技術(shù)研究［J］.園藝學(xué)報，2003，30（3）：358-360.

［13］劉柏玲，李國懷，程云清.莖尖嫁接脫除柑橘黃龍病病原及其檢測方法比較［J］.亞熱帶植物科學(xué)，2006，35（4）：4-27.

［14］李志強(qiáng)，王晶，丁國亮，等.草莓熱處理結(jié)合莖尖脫毒技術(shù)研究［J］.北方園藝，2012（5）：125-127.

［15］鄒永梅，黃雪方.費(fèi)氏石楠的組織培養(yǎng)［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，6（108）：87-89.

［16］譚文澄，戴策剛.觀賞植物組織培養(yǎng)技術(shù)［M］.北京：中國林業(yè)出版社，2001.

［17］Iyyakkannusivanesan，Sonali Jana，ByoungRyongJeong.In vitroshoot regeneration andmicrocorm development incrocus vernus （L.）Hill［J］.Pak J Bot，2014，46（2）：693-697.

［18］Haider Abbas，Muhammad Qaiser.In vitro response of Ruellia linearibracteolata to different growth hormones-an attempt toconserve an endangeredspecies［J］.Pak J Bot，2012，44（2）：791-794.

［19］Iyyakkannusivanesan，Byoung Ryong Jeong.Identification ofsomaclonal variants in proliferatingshootcultures ofseneciocruentuscv.Tokyo Daruma［J］.Plantcell Tiss Organcult 2012，111：247-253.

［20］李際紅.紅葉石楠組織培養(yǎng)快繁技術(shù)的優(yōu)化［D］.泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

［21］樊國盛，鄧?yán)蛱m.西南樺組織培養(yǎng)研究［J］.西南林學(xué)院學(xué)報，2000，20（3）：147-151.

［22］Liu BL，Yang X，Liu Jing，et al.Characterization，efficient transformation and regenetation ofchirita pumila（Gesneriaceae），a potential evo-devomodel plant［J］.Plantcell Tiss Organcult，2014，118：357-371.

［23］Liu BL，Zhang Y，Zhang K，et al.The efficient tissueculturesystem of Orostachys fimbriata［J］.Agriculsci，2016，7：175-180.

第1作者簡介：劉柏玲（1978-），女，博士，副教授，研究方向：園林植物組織培養(yǎng)技術(shù)。

（責(zé)任編輯：張亞楠）

In Vitro Regeneration Research in Photiniaserrulatacv ‘hongye’withcolored-leaf

LIU Boling
（College of Lifescience，Qufu Normal University，ShandongQufu273165）

An efficientmethod has been developed for In Vitro regeneration of Photiniaserrulatacv ‘hongye’in order to protect and utilize its genetic resources.The apical buds andstems were used as the explants to investigate the effect of different plant regulators on inducement of explants，differentiation of adventitious buds and rooting by usingmSmedium with different 6-benzylamino purine（6-BA）and 1-naphthaleneacetic acid（NAA）.The result of thisstudyshowed that the optimum inducement of explantsmedium wasmS added with 1.5mg/L 6-BA and 0.05mg/L NAA，the optimal differentiation of adventitious buds and rootingmedium weremS with 2.0mg/L 6-BA and 0.2mg/L NAA and 1/2MS+3.0mg/L NAA respectively.The differentiation rate and rooting percentage were 86.7%and 92.7%respectively.Thesurvival rate of transplants was reached 94.6%.The establishment of tissueculturesystem on Photiniaserrulatacv‘hongye’will preserve its genetic resources and provide technicalsupport for its industrial production.

Photiniaserrulatacv‘hongye’；Differentiation rate；Rooting percentage；Adventitious buds

S682.36，S603.6

A

1001-9499（2016）05-0001-04

邱念偉（1976-），男，副教授，研究方向：植物光合作用。

2016-08-20

* 山東省自然科學(xué)基金（ZR2014JL021）；曲阜師范大學(xué)博士啟動基金（bsqd20130136）；曲阜師范大學(xué)實驗技術(shù)項目（SJ201502）