RhoGDI2蛋白的高表達與結直腸癌侵襲和轉移的相關性分析

魯守堂　吳穗芳　金美玲　王啟龍　甄亞男　石會勇　李成軍　徐忠法

RhoGDI2蛋白的高表達與結直腸癌侵襲和轉移的相關性分析

魯守堂1，3吳穗芳2金美玲3王啟龍3甄亞男3石會勇3李成軍3徐忠法3

目的通過檢測RhoGTP酶解離抑制因子2（RhoGTPase dissociation inhibitor 2，RhoGDI2）在結直腸癌和癌旁組織中的表達并結合臨床病理特點進行分析，探討RhoGDI2的蛋白表達水平與結直腸癌侵襲轉移的關系及在腫瘤發生發展中的作用。方法選取山東省醫學科學院附屬醫院2012年07月至2014年07月采取手術切除的153例結直腸癌病例，采用免疫組織化學檢測153例腫瘤組織標本和癌旁標本中RhoGDI2蛋白的表達水平。結果RhoGDI2蛋白在結腸癌組織中呈陽性表達，且主要在胞漿中表達；但在癌旁正常組織中無陽性表達（57.5% vs 0.00%）。結直腸癌組織中RhoGDI2蛋白的表達在低分化組顯著高于高中分化組（χ2=2.090，P＜0.05）。RhoGDI2的陽性表達與結直腸腫瘤的大小呈正相關，腫瘤越大陽性表達率越高（χ2=4.293，P＜0.05），并隨著腫瘤浸潤深度陽性表達率增加（χ2=1.711，P＜0.05），其在有淋巴結轉移者表達顯著高于無淋巴結轉移者（χ2=5.925，P＜0.05）、有遠處轉移者顯著高于無遠處轉移者（χ2=5.519，P＜0.05），并且與臨床分期密切相關，分期較晚的顯著高于分期較早的（χ2=5.683，P＜0.05）。RhoGDI2在結直腸癌中的陽性表達與年齡（＜60 years vs ≥60 years）（χ2=0.054，P＞0.05），性別（χ2=0.037，P＞0.05）無相關性。結論RhoGDI2在結直腸癌中高表達，并且與結直腸癌的局部侵襲和遠處轉移呈正相關。RhoGDI2可能在結直腸的發生發展和侵襲轉移過程中起著重要的作用。

結直腸腫瘤；腫瘤轉移；侵襲；RHOGTP酶解離抑制因子2

結直腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一。據全國腫瘤登記中心披露的數據顯示2015年結直腸癌位于中國腫瘤發病率及癌癥死亡率的第五位［1］。隨著生活水平的提高及高脂肪低纖維素飲食的比例增加，結直腸癌的發生率在我國呈比例上升。2011年結直腸癌的發病率和死亡率分別為23.03/10萬和11.1/10萬。其中城市地區遠高于農村，且結直腸癌的發病率顯著上升，多數患者發現時已屬于中晚期。25%的結直腸癌患者在確診時即合并肝轉移，另有30%～40%的患者在結直腸癌原發病灶根治術后發生復發及遠處轉移［2］。其中腫瘤的侵襲和轉移是主要的影響因素，關于侵襲和轉移相關因子的研究如火如荼，在前期研究中我們發現鳥嘌呤核苷酸解離抑制因子2（RhoGTPase dissociation inhibitor，RhoGDI2）在胃癌中呈高表達，并且與腫瘤侵襲和轉移呈正相關。結直腸腫瘤與胃癌同屬于消化道腫瘤，推測該因子也許與結直腸腫瘤的侵襲和轉移相關，于是進行了RhoGDI2在結直腸腫瘤中的表達及侵襲轉移相關的研究。

資料與方法

一、一般資料

石蠟切片：樣本選取山東省醫學科學院附屬醫院2012年07月至2014年07月采取手術切除的153例結直腸癌病例，所有病例均有完整的臨床資料，均病理證實，并未接受術前放化療（表1）。結直腸癌TNM分期依據美國癌癥聯合會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第七版分期標準。本試驗經山東省醫學科學院倫理委員會論證通過，并全部已與患者簽署知情同意書，標本經石蠟包埋、標準條件存放。所有病例標本包含腫瘤組織及癌旁組織兩部分。兔抗人RhoGDI2抗體購自ABCAM公司；SP免疫染色試劑盒，DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

表1　RhoGDI2蛋白表達與結直腸癌臨床病理特點的關系表

二、方法

（一）免疫組織化學染色

切片，70℃，30 min脫蠟，二甲苯浸泡5 min×2次，梯度乙醇脫水，水洗，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer solution，PBS）沖洗1遍，枸櫞酸浸泡，熱修復，3% H2O2去離子水避光孵育10 min，PBS沖洗3次×3 min，滴加一抗（1：200），4℃過夜；PBS洗3次×3 min，滴加聚合物輔助劑（試劑A）室溫孵育20 min，PBS洗3次×3 min，滴加辣根素過氧化物酶標記羊抗兔/小鼠IgG多聚體（試劑B），37℃孵育20 min，PBS洗3次×3 min，新鮮配制DAB顯色，蒸餾水洗滌，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，以PBS替代一抗作為陰性對照，用已知陽性胎盤切片作為陽性對照。

（二）免疫組織化學染色結果評定

各用光學顯微鏡觀察免疫組織化學切片，進行半定量評估，在高倍顯微鏡下對每張切片隨機選擇5視野，判斷結果依據Shimizu方法［6］。對每張切片陽性細胞的陽性強度按無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別打0、1、2、3分，著色陽性細胞比率按0%、0～10%；10%～50%；51%～80%；＞80%分別打0、1、2、3、4分，然后根據兩項打分之和判斷其結果，分數≥3分為陽性。本試驗所有切片均有兩名有經驗的病理科醫生采取雙盲法評估。

三、統計學分析

統計學分析借助于SPSS 22.0軟件，將病例資料按照性別、年齡、原發灶直徑、原發灶浸潤深度、組織學分級、淋巴結轉移、遠處轉移、疾病分期分為兩組，分別將RhoGDI2陽性表達率進行χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結　果

在選取的153例結直腸癌組織中，RhoGDI2蛋白在結直腸腺癌的陽性率為57.5%。RhoGDI2蛋白在結直腸癌旁組織不表達，兩者之間差異有統計學意義。

其中原發灶直徑（≥5 cm）陽性率64.4%，直徑（＜5 cm）陽性率47.4%，兩者差異有統計學意義（χ2=4.293，P＜0.05）。高中分化陽性率52.7%，低分化陽性率64.5% （χ2=2.090，P＜0.05）。TNM分期Ⅰ、Ⅱ期組陽性率47.6%，Ⅲ、Ⅳ期組陽性率66.3%（χ2=5.683，P＜0.05），兩者差異有統計學意義。有淋巴結轉移組陽性率67.6%，無淋巴結轉移陽性率48.1%（χ2=5.925，P＜0.05）兩者差異有統計學意義。原發灶浸潤深度（T1-2）陽性率51.5%，T3-4陽性率66.7%（χ2=1.711，P＜0.05），兩者差異有統計學意義。有遠處轉移的陽性率67.6%，無遠處轉移的陽性率48.7%，兩者差異有統計學意義（χ2=5.519，P＜0.05）。RhoGDI2蛋白陽性表達率與性別（χ2=0.037，P＞0.05）、年齡（＜60，≥60）（χ2=0.054，P＞0.05）無關。（表1，圖1）

討　論

結直腸癌是消化系統較常見的惡性腫瘤，據國家癌癥中心發布的數據顯示，2015年結直腸癌的發病率及癌癥相關死亡率均位于第五位，并呈逐年上升趨勢。腫瘤的轉移和復發是影響預后的主要因素，關于相關的分子調節機制目前仍不明了。

惡性腫瘤的復發和轉移與腫瘤細胞的特性相關，其中包括改變細胞間粘連，獲得運動侵襲性，對微環境的適應性生存，可以進入血管和淋巴管循環。在這一過程中RhoGTP酶家族參與了許多關鍵步驟，是諸多關鍵步驟的關鍵因子，比如控制細胞傳導通路，調節包括基因的表達，細胞生長過程，細胞骨架的重排，微管結構、細胞膜內外信號的傳導等許多生物過程。其主要因子包括Rho、Rac1和CDC42［3-4］。

RhoGDI2是Rho家族的一員，通過調節RhoGTP酶的活性而發揮作用的關鍵因子［5］。其是由Lelias和Scherle P發現在造血組織和淋巴細胞優先表達。在以后的研究中發現它在惡性腫瘤中也表達，但是在腫瘤的作用卻不相同。這激起了許多醫學研究者的興趣，2002年研究者發現RhoGDI2在膀胱癌低侵襲性細胞中高表達，而在高侵襲性細胞株中不表達，并能抑制細胞的侵襲和運動從而抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移［6］。是膀胱癌獨立的預后預測因子［7］。RhoGDI2在體內肺鱗癌和腺癌組織中表達較弱或基本不表達，并且與腫瘤侵襲和轉移呈負相關［8］。在霍奇金淋巴瘤中呈低表達［9］。在其后的研究中，發現RhoGDI2在乳腺癌中呈雙向表達，先升高后降低的兩階段模式，并且表達的降低與淋巴結轉移相關，可以抑制腫瘤轉移的作用。RhoGDI2在不同的腫瘤中出現表達水平不同，并且在不同的腫瘤中呈現完全相反的作用，需要更加深入的研究。我們前期研究發現RhoGDI2在胃癌中呈現高表達，并且與胃癌分化程度、浸潤程度、淋巴結轉移、遠處轉移及臨床分期密切相關。在低分化、T3-4期、淋巴結轉移、遠處轉移和TNM分期較晚的胃癌組織中顯著表達，與胃癌的侵襲和轉移的過程中發揮重要的作用［10］。與國外Cho等相關的研究獲得相同的結果［11］。

關于RhoGDI2在結直腸癌中的研究，XL Bsc等［12］發現RhoGDI2在結直腸癌中表達與腫瘤大小浸潤深度，Duke′s分期明確相關，并且可以作為結直腸癌的獨立預后預測因子。國內尚欠缺RhoGDI2在結直腸癌中蛋白表達及機制的研究。本實驗通過免疫組織化學染色方法，檢測RhoGDI2在結直腸癌組織中蛋白表達。結果表明RhoGDI2在結直腸癌陽性率高達57.5%，在癌旁正常組織中表達陰性。在與病理結果進行進一步分析后發現RhoGDI2的表達與結直腸癌分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移及臨床分期密切相關。在低分化，T3-4期，淋巴結轉移及遠處轉移和Duke?s分期晚的結直腸癌組織中表達顯著升高，大多數在細胞漿中表達，印戒細胞中細胞核中也有表達。我們的實驗表明RhoGDI2在結直腸癌的侵襲和轉移過程中發揮重要的作用，但是RhoGDI2在結直腸癌的侵襲和轉移中的相關因子及信號通路仍不明確，需要我們進一步的研究?；仡櫹嚓P文獻RhoGDI2在不同的腫瘤組織中對腫瘤的作用不同，是其調控因子或者上游因子的作用不同？還是本身的作用機制和引起的信號傳導通路不同？目前尚不清楚，仍需要進一步的研究。

圖1　RhoGDI2蛋白在正常組織和癌組織中的表達。A：正常組織表達陰性（×200）；B：高分化腺癌RhoGDI2表達陽性（×200）；C：中分化腺癌表達陽性（×200）；D：低分化腺癌表達陽性（×200）

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Overexpression of RhoGDI2 protein correlates with tumor invasion and metastasis in colorectal cancer

Lu Shoutang1，3， Wu Suifang2， Jin Meiling3， Wang Qilong3， Zhen Yanan3， Shi Huiyong3， Li Chengjun3， Xu Zhongfa3.1
School of Medicine and life Sciences， University of Jinan-Shandong Academy of Medical Sciences，Jinan 250200，China；2Department of Medical oncology， Shandong Tumor Hospital， Shandong 250117，China；3Department of Gastrointestinal Surgery， Affiliated Hospital of Shandong Academy of Medical Sciences， Jinan 250031， China

Xu Zhongfa， Email: xzfa2216@126.com

ObjectiveTo detect the expression of Rho GDP dissociation inhibitor 2 （RhoGDI2）and analyze the function of RhoGDI2 in the colorectal cancer. To discuss the role of RhoGDI2 in the developmetal process of colorectal cancer. MethodsImmunohistochemistry was used to detect RhoGDI2 protein in 153 cases of colorectal cancer and adjacent tissue specimens. ResultsSpecimens from 153 cases of colorectal cancer were selected from Affiliated Hospital of Shandong Academy of Medical Sciences between July 2012 and July 2014. RhoGDI2 was expressed mainly in colorectal cancer， mainly in the cytoplasm. The positive rate of RhoGDI2 protien expression was significantly higher in cancer tissue than in normal colorectal tissue （57.5 % vs 0.00%）. RhoGDI2 expression in colorectal cancer tissue with thelow differentiation group was significantly higher than in the high and moderate differentiation group. The expression of RhoGDI2 protein in colorectal cancer was significantly correlated with tumor size （χ2=4.293，P＜0.05）， grade of differentiation （χ2=2.090， P＜0.05）， depth of invasion （χ2=1.711， P＜0.05）， lymph node metastasis （χ2=5.925， P＜0.05）， distant metastasis （χ2=5.519， P＜0.05）， and clinical stage （χ2=5.683，P＜0.05）. RhoGDI2 expression in colorectal cancer was no correlated with gender （χ2=0.037， P＞0.05）、age （＜60 years vs≥60 years） （χ2=0.054， P＞0.05）. ConclusionsRhoGDI2 expression was positively correlated with the invasion and metastasis of colorectal cancer， and RhoGDI2 may play an important role in the occurrence and development of colorectal cancer.

Colorectal neoplasms；Neoplasm metastasis；Invasion；RhoGDI2

2016-04-13）

（本文編輯：楊明）

10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2016.04.010

山東省醫學科學院青年基金資助項目（No.2012-35）

250200濟南大學山東省醫學科學院醫學與生命科學學院1；250117山東省腫瘤醫院腫瘤內科2；250031山東省醫學科學院附屬醫院胃腸外科3

徐忠法，Email：xzfa2216@126.com

魯守堂，吳穗芳，金美玲，等. RhoGDI2蛋白的高表達與結直腸癌腫瘤侵襲和轉移的相關性分析［J/CD］.中華結直腸疾病電子雜志， 2016， 5（4）: 328-332.