蒙古黃芪種子消毒劑的篩選及愈傷組織誘導

張 芳，薄越洋，樊彥彤，何 瑞，張 潔

（山西農業大學信息學院，山西太谷 030800）

蒙古黃芪（Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao）為豆科黃芪屬多年生草本，以根入藥，其味甘微溫，具有補氣固表、利尿、抗病毒等功效，對肢體麻木、腎炎浮腫、創傷不易愈合等療效顯著，被稱為“補藥之長”，是臨床常用中藥之一[1-3]。在現代醫學研究中，特別是在我國2020 年初出現的新冠肺炎治療過程中，發現黃芪對于緩解新冠肺炎病情和抑制病毒的擴散具有顯著的效果[4]。隨著黃芪研究和應用的不斷擴展，野生資源多瀕臨滅絕，人工種植也由于黃芪種子萌發率低等原因而影響其大量栽培，無法滿足市場需求[5]。利用植物組織培養快速繁殖黃芪不僅可在短期內培養大量優質苗，還可為開展黃芪毛狀根轉基因研究提供基礎材料。

組培快繁是保護植物種質資源和擴繁種苗的有效途徑，近年來對黃芪組培快繁開展了許多研究工作。洪森榮等[6]研究表明，KT 和2，4-D 均可促進膜莢黃芪試管苗帶芽莖段根和芽的再生。張延紅等[7-8]以蒙古黃芪莖段為外植體，篩選了初代培養和繼代培養的適宜培養基，并研究了溫度和pH 對黃芪組織培養的影響。郭生虎等[9]以膜莢黃芪無菌苗為外植體，研究了不同激素種類及其濃度配比對愈傷組織誘導率、叢生芽誘導率、再生苗生根率的影響，并篩選出適宜的培養基配方。這些研究多以帶芽莖段、無菌苗下胚軸為外植體開展相關試驗，對不同外植體進行比較篩選的研究不多。另外，由種子萌發的無菌苗是誘導愈傷組織的良好外植體，但黃芪種子本身萌發率偏低[10]，消毒處理不當則會影響無菌苗的獲得。因此，篩選適宜的消毒劑是初代培養成功的關鍵因素之一，周吉林[11]研究表明，采用98%的濃硫酸滅菌黃芪種子3 min 效果較好。升汞和次氯酸鈉也具有良好的消毒滅菌作用[12]，但目前尚未見對黃芪種子滅菌效果的相關研究。

本試驗以蒙古黃芪種子為試驗材料，以0.1%HgCl2和2%NaClO 對其進行滅菌處理，獲得無菌苗，分別以黃芪無菌苗下胚軸和葉片為外植體誘導愈傷組織產生，以篩選最適誘導培養基，并通過繪制愈傷組織生長曲線，確定其繼代培養周期，旨在為黃芪組織快繁及開展轉基因相關研究提供技術支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為蒙古黃芪種子，購自山西省種子公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃芪種子的滅菌和萌發 選取優質飽滿的黃芪種子，剝去種皮，用75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗3 次；再分別用0.1%HgCl2和2%NaClO 滅菌不同時間（表1），無菌水沖洗4 次后，接種到MS 培養基上（瓊脂6 g/L、蔗糖25 g/L、pH 值5.8），置于（25±1）℃培養箱進行暗培養；每個處理接種6 瓶，每瓶8 粒，每隔1 d 觀察記錄黃芪種子的發芽率（當胚根長比種子高1/2 時，即為黃芪種子發芽）。

表1 2 種消毒劑不同處理時間

1.2.2 以下胚軸為外植體的愈傷組織誘導 種子萌發后，置于溫度為（25±1）℃、光周期為16 h/8 h（光/暗）、光強為2 000 lx 的溫室內培養，得到無菌苗。以黃芪無菌苗的下胚軸為外植體，接種到附加不同質量濃度NAA、2，4-D 和6-BA 的MS 培養基中（表2），置于溫度為（25±1）℃進行暗培養誘導愈傷組織；每個處理接種8 瓶，每瓶接種5 個。25 d 后統計愈傷組織的誘導個數，計算誘導率，并觀察其生長情況。1.2.3 以葉片為外植體的愈傷組織誘導 取黃芪無菌苗葉片切成大小約為2 mm×2 mm 的小塊，接種于添加不同質量濃度的NAA、2，4-D 和6-BA 的MS 培養基中（表3）。培養條件同1.2.2。每個處理接種8 瓶，每瓶接種5 個。接種25 d 后統計愈傷組織的誘導個數，計算誘導率，并觀察其生長情況。

表2 誘導黃芪下胚軸愈傷組織的不同激素配比

表3 誘導黃芪葉片愈傷組織的不同激素配比

1.2.4 愈傷組織繼代周期的確定 將下胚軸和葉片誘導獲得的愈傷組織分別轉接入1.2.2 和1.2.3試驗篩選出的最適培養基中進行增質量研究。每5 d測定一次愈傷組織鮮質量，培養30 d，并繪制其生長曲線。

2 結果與分析

2.1 不同消毒劑及處理時間對黃芪種子萌發的影響

黃芪種子接種第8 天開始出芽，第25 天黃芪種子萌發情況統計結果如表4 所示。

表4 2 種消毒劑不同滅菌時間對黃芪種子萌發的影響

從表4 可以看出，0.1%HgCl2處理中，A3 處理（10 min）的種子萌發率和芽體平均高度最高，分別為73%和13.7 cm；A1、A2 處理種子滅菌不完全，仍有污染現象；A4 處理可能對種子的毒害作用較大，抑制種子的萌發和生長。2%NaClO 處理中，B3 處理（20 min）的種子萌發率最高，為68%；B2 處理的種子萌發后芽體平均高度最高，為12.6 cm。綜上可見，0.1%HgCl2滅菌處理10 min 為蒙古黃芪種子的最適滅菌方法。

2.2 激素對黃芪無菌苗下胚軸誘導愈傷組織的影響

由表5 可知，培養基中單獨附加2，4-D（C1～C4）時，C2（MS＋1.0 mg/L 2，4-D）的愈傷組織誘導率最高，為83%，且愈傷組織生長健壯，質地疏松適度，褐化較輕；2，4-D 質量濃度過高或過低時，愈傷組織誘導率明顯下降，且生長緩慢，組織易產生硬塊褐化。單獨附加不同質量濃度6-BA（C5～C8）時，愈傷組織誘導率最高也僅為43%，且生長情況較差，色白無光澤，褐化程度嚴重，延長培養時間則逐漸死亡。單獨添加不同質量濃度NAA（C9～C12）時，愈傷組織誘導率隨NAA 質量濃度增加而逐漸提高，當質量濃度達到3.0 mg/L 時，愈傷組織誘導率最高，為63%，愈傷組織呈淡黃色，逐漸發生褐化。故附加單一激素時，C2 為最適培養基。

表5 單激素對黃芪下胚軸愈傷組織誘導的影響

由表6 可知，2，4-D 與6-BA 配比（C13～C17）時，C17 的愈傷組織誘導率最高，可達100%，但愈傷組織褐化程度較高；C16（MS＋2.0 mg/L 2，4-D＋0.5 mg/L 6-BA）愈傷組織誘導率較高，為88%，且其褐化程度較低。NAA 和6-BA 配比（C18～C22）時，愈傷組織誘導速度較慢，但誘導出的愈傷組織不易發生褐化，隨著NAA 質量濃度的增加，誘導出的愈傷組織由黃褐色變成黃乳白色，其質地也由硬實變為疏松，其中，C21（MS＋2.0 mg/L NAA＋1.0 mg/L 6-BA）的誘導率最高，為80%。綜上，C16 為下胚軸誘導愈傷組織的適宜培養基，且誘導率比單獨附加2，4-D 時高。

表6 不同激素配比對黃芪下胚軸愈傷組織誘導的影響

2.3 不同激素配比對黃芪無菌苗葉片愈傷組織誘導的影響

從表7 可以看出，2，4-D 單獨作用（E1～E3）時，以E3 誘導率最高，為65%，但愈傷組織褐化較為嚴重，不利于芽的分化。雙激素共同作用（E4～E9）時，以E9（MS＋2.0 mg/L 6-BA＋2.0 mg/L NAA）愈傷組織誘導率最高，為85%，且誘導出的愈傷組織質地緊密、堅硬，呈現淺綠色或綠色。此外，當培養基中6-BA 與2，4-D 和NAA 配比相同時（E4 與E7、E6 與E8），含有NAA 的愈傷誘導率高于含有2，4-D 的培養基，即E7 和E8 的誘導率高于E4 和E6，且愈傷組織質地較緊實。三激素共同作用（E10～E12）時，以E12（MS＋2.0 mg/L 6-BA＋1.0 mg/L NAA＋1.0 mg/L 2，4-D）愈傷組織誘導率最高，為93%，且生長良好，較E9 的褐化程度低，故E12 為葉片誘導愈傷組織的最適培養基。

表7 不同激素配比對黃芪葉片愈傷組織誘導的影響

2.4 愈傷組織繼代周期的確定

將下胚軸和葉片誘導的愈傷組織分別轉接入篩選出的適宜培養基C16 和E12 中，每5 d 測定愈傷組織的鮮質量一次，并繪制生長曲線如圖1 所示。由圖1 可知，下胚軸和葉片誘導的愈傷組織生長曲線均呈S 形，二者變化趨勢基本相同，均未出現明顯的直線生長期。在接種后5 d 進入對數生長期，且下胚軸誘導的愈傷組織增長快于葉片誘導愈傷組織；下胚軸誘導愈傷組織生長15 d 后進入緩慢生長期，而葉片誘導的愈傷組織在生長20 d 左右才進入緩慢生長期；2 種愈傷組織均在25 d 后進入生長停滯期。因此，愈傷組織培養以20～25 d 為一個繼代周期，可以保持其旺盛生長。此外，下胚軸誘導的愈傷鮮質量均高于葉片誘導的愈傷鮮質量。

3 結論與討論

外植體滅菌是初代培養能否成功的關鍵因素之一。李娜等[10]、周吉林[11]分別用濃硫酸、H2O2、砂撞和滅菌的自來水對黃芪種子進行滅菌，結果發現，濃硫酸、H2O2腐蝕性強，處理后種子的死亡率較高，且濃硫酸操作危險；砂撞處理安全但發芽率低。本試驗分別用0.1% HgCl2和2% NaClO 滅菌不同時間以篩選適合黃芪種子滅菌的消毒劑，結果表明，0.1%HgCl2比2%NaClO 滅菌后種子萌發率高，滅菌效果好，以0.1%HgCl2滅菌10 min 為蒙古黃芪種子的適宜滅菌方法。

關于黃芪組培快繁已有不少報道，其研究一方面集中在以腋芽、莖尖或莖段為外植體直接誘導芽萌動叢芽[13-14]，另一方面則通過外植體誘導愈傷組織并分化形成再生植株[15-19]。而影響愈傷組織形成的兩大關鍵因素為外植體的選擇和培養基中的激素配比[20]。張強等[21]以膜莢黃芪的子葉、下胚軸、幼莖、幼葉為外植體誘導愈傷組織，結果發現，子葉是最佳的外植體，MS＋0.5 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L NAA為其愈傷組織誘導的最佳培養基。本試驗分別以蒙古黃芪的下胚軸和葉片為外植體誘導愈傷組織，結果發現，下胚軸誘導愈傷組織的適宜培養基為MS＋2.0 mg/L 2，4-D＋0.5 mg/L 6-BA，這與郭生虎等[9]的研究結果一致。葉片誘導愈傷組織的適宜培養基為MS＋2.0 mg/L 6-BA＋1.0 mg/L 2，4-D＋1.0 mg/L NAA。通過下胚軸愈傷組織和葉片愈傷組織分別在其最適培養基上的生長鮮質量曲線可知，黃芪下胚軸愈傷組織生長略強于葉片愈傷組織生長，二者均在生長第5 天進入對數生長期，第25 天進入生長停滯期。故蒙古黃芪愈傷組織繼代培養以20～25 d為一個周期較為適宜，可保持其旺盛生長。

本研究通過對蒙古黃芪種子萌發前進行不同的消毒處理，確定0.1%HgCl2滅菌10 min 的發芽率最高，獲得無菌苗后，以下胚軸和葉片為外植體的愈傷組織誘導發現，MS＋2.0 mg/L 2，4-D＋0.5 mg/L 6-BA 為以下胚軸為外植體愈傷組織誘導的適宜培養基，MS＋2.0 mg/L6-BA＋1.0 mg/L2，4-D＋1.0 mg/L NAA 為以葉片為外植體愈傷組織誘導的適宜培養基，誘導率分別為88%和93%。由愈傷組織生長曲線可知，20～25 d 為一個繼代周期。該結果為蒙古黃芪的組培快繁提供了理論基礎。