亮甲酚藍(lán)優(yōu)選哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞技術(shù)研究進(jìn)展

王俊敏　唐易　張錦

摘要 隨著動(dòng)物胚胎工程技術(shù)的不斷發(fā)展，卵母細(xì)胞的需求量不斷增大。卵母細(xì)胞的質(zhì)量決定植入前早期胚胎發(fā)育的效率，為此篩選出優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞對(duì)于提高后續(xù)胚胎的發(fā)育起著決定性的作用。本文就亮甲酚藍(lán)染色篩選成熟培養(yǎng)前的卵母細(xì)胞，對(duì)于卵母細(xì)胞質(zhì)量、后續(xù)胚胎發(fā)育效率和早期胚胎發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響方面的研究予以綜述，期望對(duì)于同行有一定的借鑒意義。

關(guān)鍵詞 亮甲酚藍(lán)；卵母細(xì)胞；胚胎發(fā)育；胞質(zhì)成熟

中圖分類號(hào) S813.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2016）08-0238-01

Abstract With the continuous development of animal embryo engineering and technology，the demand of oocytes is increasing a lot.Oocyte quality can affect the efficiency of early embryonic development，so it plays a decisive role for subsequent embryonic development through selecting high-quality oocytes.In this paper，the effects of Brilliant Cresol Blue staining（BCB）on further embryo development were reviewed，which included the quality and efficiency of subsequent embryonic development and the influence of gene expression of early embryo.It was expected that it would be helpful for their peers in the early embryo development research fields.

Key words brilliant cresyl blue（BCB）；oocyte；embryo development；cytoplast maturation

生長(zhǎng)期的卵母細(xì)胞代謝旺盛，含有大量的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH），但是隨著卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)期結(jié)束其活性也逐漸降低直至消失，因此卵母細(xì)胞成熟時(shí)G6PDH的含量很少。卵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)采用亮甲酚藍(lán)（BCB）染色，由于G6PDH可以使BCB由原來(lái)的藍(lán)色變成無(wú)色，因此可以分辨出生長(zhǎng)期的卵母細(xì)胞和成熟的卵母細(xì)胞，前者表現(xiàn)為胞質(zhì)未著色（BCB-），而后者則胞質(zhì)呈藍(lán)色（BCB+）。因此，BCB染色技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于多種動(dòng)物卵母細(xì)胞的篩選，并取得了很好的效果[1-4]。此外，已有的研究認(rèn)為，處于生長(zhǎng)階段的卵母細(xì)胞的發(fā)育能力遠(yuǎn)低于成熟期的卵母細(xì)胞，因此通過(guò)BCB染色技術(shù)還能夠間接的評(píng)估卵母細(xì)胞的質(zhì)量。通過(guò)采用BCB對(duì)成熟培養(yǎng)前的豬[1- 2]、山羊[3]、綿羊[5]和牛[6-7]卵母細(xì)胞染色用于檢測(cè)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶間接評(píng)價(jià)優(yōu)選卵母細(xì)胞，為后續(xù)研究提供優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)未著色的卵母細(xì)胞培養(yǎng)成熟后，用于核移植具有更高的體外囊胚發(fā)育率[8- 9]。在動(dòng)物胚胎生產(chǎn)中，主要從屠宰場(chǎng)采集卵巢，由于挑選的卵母細(xì)胞來(lái)自不同生長(zhǎng)階段的卵泡，導(dǎo)致了卵母細(xì)胞質(zhì)量存在差異。

本文就BCB在篩選成熟培養(yǎng)前的卵母細(xì)胞后，對(duì)于卵母細(xì)胞質(zhì)量、后續(xù)胚胎發(fā)育效率和早期胚胎發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響方面的研究予以綜述，期望對(duì)于動(dòng)物胚胎工程研究領(lǐng)域的同行有一定的借鑒意義。

1 BCB篩選卵母細(xì)胞質(zhì)量的研究

在BCB篩選小鼠卵母細(xì)胞的研究方面，有研究發(fā)現(xiàn)[10]，BCB+ 組的卵母細(xì)胞染色體周?chē)巳实臄?shù)量較多，并且其胞質(zhì)成熟較充分（通過(guò)GSH水平和線粒體的分布方式），成熟后期具有較好的發(fā)育潛力。這個(gè)結(jié)論已經(jīng)在很多動(dòng)物中卵母細(xì)胞篩選中得到證實(shí)，概述如下。

（1）在BCB篩選牛卵母細(xì)胞的研究方面，有研究發(fā)現(xiàn)：用26、39、52 μmol/L的亮甲酚藍(lán)染色后所得到的BCB+組（27.7%、27.6%、31.9%），較13 μmol/L的亮甲酚藍(lán)染色后所得到的BCB+ 組（2.1%）差異顯著，而且其BCB染色后，BCB+組的體外成熟率（77.4%）顯著高于BCB- 組（51.3%）和對(duì)照組（60.2%）[11]。

（2）在BCB篩選豬卵母細(xì)胞的研究方面，有研究發(fā)現(xiàn)：BCB+ 組卵母細(xì)胞的核成熟率（80.8%）顯著高于BCB- 組（44.2%）和空白對(duì)照組（72.4%）[12]。此外，在通過(guò)BCB染色提高豬體外胚胎培養(yǎng)體系的效率的研究中發(fā)現(xiàn)[13]：BCB+ 組的豬卵母細(xì)胞的91.16%已經(jīng)達(dá)到減數(shù)分裂Ⅱ期，顯著高于BCB-組（64.10%）和對(duì)照組（77.15%）。

（3）在BCB篩選山羊卵母細(xì)胞的研究方面，有研究發(fā)現(xiàn)：BCB+ 和BCB- 組的卵母細(xì)胞的平均直徑分別為136.6、125.5 μm，可見(jiàn)BCB+ 組的卵母細(xì)胞顯著長(zhǎng)于BCB- 組（P<0.001）；BCB+ 和BCB- 組的卵母細(xì)胞的體外成熟率分別為81.4%和52.5%，并且BCB+ 組也顯著高于對(duì)照組（72.4%）；此外，BCB+組卵母細(xì)胞的正常受精率（23.5%）也顯著高于BCB- 組（8.2%） 和對(duì)照組（11.9%）[14]。

由此可見(jiàn)，以亮甲酚藍(lán)染色為基礎(chǔ)的哺乳動(dòng)物卵丘—卵母細(xì)胞復(fù)合體的區(qū)分可以用來(lái)有效地選擇更具發(fā)育活力的卵母細(xì)胞，為后續(xù)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究奠定基礎(chǔ)。

2 BCB篩選后早期胚胎發(fā)育效率的研究

在研究BCB對(duì)于牛卵母細(xì)胞選擇后胚胎進(jìn)一步的發(fā)育發(fā)現(xiàn)，胞質(zhì)染藍(lán)色的牛體外受精胚胎的囊胚率達(dá)到32.99%，而對(duì)照組和無(wú)色組分別為17.64%和3.57%；同時(shí)進(jìn)一步進(jìn)行核移植研究發(fā)現(xiàn)，在用BCBG篩選的卵母細(xì)胞進(jìn)行核移植研究發(fā)現(xiàn)[15]：BCB+ 組不僅可以獲得較高的核移植囊胚率，而且其囊胚細(xì)胞總數(shù)也顯著高于對(duì)照組、控制對(duì)照組和BCB- 組[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)BCB篩選能夠顯著降低牛卵母細(xì)胞后續(xù)的胚胎發(fā)育細(xì)胞凋亡率，BCB+ 組、對(duì)照組和BCB- 組的凋亡率分別為6.50%、28.21%、39.06%。最近的研究發(fā)現(xiàn)，BCB+ 組的孤雌囊胚形成率達(dá)到32.9%，而B(niǎo)CB- 組的孤雌囊胚形成率僅為10.1%；BCB+ 組顯微操作核移植胚胎的囊胚發(fā)育率（14.1%）顯著高于BCB- 組（3.4%），但與對(duì)照組之間無(wú)顯著差異；各組手工克隆胚胎發(fā)育率之間無(wú)顯著差異[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，BCB+ 組、對(duì)照和BCB- 組孤雌豬胚胎的囊胚率分別為34.19%、23.11%和9.15%，BCB+ 組比BCB- 組顯著高25.04%；BCB+核移植豬胚胎的囊胚率可以達(dá)到23.10%，而B(niǎo)CB- 組的囊胚率僅有5.10%。通過(guò)對(duì)BCB染色的豬卵母細(xì)胞的孤雌胚胎和核移植胚胎發(fā)育情況的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，BCB+組孤雌囊胚率和核移植囊胚率分別為34.28%和23.74%，顯著高于BCB- 組（12.25%和6.28%）和對(duì)照組（26.52%和17.05%），并且BCB+ 組具有較多的囊胚細(xì)胞[17]。

綜上可見(jiàn)，以亮甲酚藍(lán)染色為基礎(chǔ)的卵丘—卵母細(xì)胞復(fù)合體的區(qū)分可以用來(lái)有效地選擇更具發(fā)育活力的卵母細(xì)胞，其后續(xù)構(gòu)建的胚胎具有更大的發(fā)育潛力。因此，亮甲酚藍(lán)可用于卵母細(xì)胞染色的選擇，并作為判斷卵母細(xì)胞質(zhì)量的一個(gè)重要標(biāo)記。

3 BCB篩選后早期胚胎相關(guān)基因表達(dá)的研究

最近的研究發(fā)現(xiàn)，BCB+ 組卵母細(xì)胞的胞質(zhì)成熟對(duì)于受精后正常的胚胎發(fā)育是至關(guān)重要的，亮甲酚藍(lán)染色液（BCB）能有效篩選出胞質(zhì)成熟卵母細(xì)胞[18]。為進(jìn)一步了解經(jīng)過(guò) BCB 篩選的卵母細(xì)胞中母源基因mRNA表達(dá)量的差異性，進(jìn)而更為準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)BCB對(duì)卵母細(xì)胞篩選的可行性和可靠性，判斷母源基因與卵母細(xì)胞的胞質(zhì)成熟的相關(guān)性，為深入了解哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育提供技術(shù)手段。經(jīng)過(guò) BCB篩選后對(duì)于不同類卵母細(xì)胞的母源性物質(zhì)表達(dá)差異研究表明，4種母源基因（Gdf9、Mater、Zar1和Dnmt1）在BCB+卵母細(xì)胞中的表達(dá)量顯著低于BCB- （P<0.05），說(shuō)明上述基因的 mRNA表達(dá)量可能與卵母細(xì)胞的質(zhì)量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。此外，研究結(jié)果還表明，越接近成熟24 h的綿羊卵母細(xì)胞其玻璃化冷凍保存的效果越好，而上述4種基因的mRNA表達(dá)量與玻璃化冷凍呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，可能與卵母細(xì)胞質(zhì)量、體外培養(yǎng)效率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[19]。

綜上所述，亮甲酚藍(lán)染色篩選成熟培養(yǎng)前的卵母細(xì)胞，可以作為獲取優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞的一個(gè)有效方法，為后續(xù)重構(gòu)胚胎提供優(yōu)質(zhì)的卵母細(xì)胞，從而提高其胚胎的發(fā)育效率。但是有關(guān)BCB篩選卵母細(xì)胞后，胚胎后續(xù)發(fā)育過(guò)程中有關(guān)對(duì)于表觀遺傳以及涉及的子代安全性的問(wèn)題還未見(jiàn)研究性報(bào)道，所以需要進(jìn)一步對(duì)亮甲酚藍(lán)篩選優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞的方法進(jìn)行驗(yàn)證，確保該篩選優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞方法的可行性。

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