一株米曲霉產(chǎn)纖維素酶條件的優(yōu)化

李麗　趙宏濤　閆洪雪

摘要 以一株實(shí)驗(yàn)室保存的米曲霉M1102為出發(fā)菌株，研究固態(tài)環(huán)境中碳源、氮源、初始pH值、含水量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間等因素對米曲霉產(chǎn)纖維素酶活力的影響。結(jié)果表明：當(dāng)碳源為麩皮，氮源為豆餅粉，初始pH值為6.5，含水量為50%，培養(yǎng)溫度為30 ℃，培養(yǎng)時間為60 h時，米曲霉產(chǎn)纖維素酶活力最高。

關(guān)鍵詞 米曲霉；固態(tài)發(fā)酵；纖維素酶活

中圖分類號 S147.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）08-0197-02

Abstract The culture conditions affected the production of cellulose enzyme by Aspergillus oryzae，such as carbon source，nitrogen source，initial pH，water content，culture temperature，culture time，etc.The results showed that when the carbon source was bran，nitrogen source was powder of bean cake，initial pH value was 6.5，moisture content was 50%，culture temperature was 30 ℃，training time was 60 h，the cellulose enzyme activity produced by Aspergillus oryzae was the highest.

Key words Aspergillus oryzae；solid-state fermentation；cellulose enzyme activity

我國農(nóng)作物秸稈的利用率普遍很低，多數(shù)作物秸稈都作焚燒處理，對環(huán)境的污染很大。作物秸稈中含有豐富的有機(jī)質(zhì)、氮、磷、鉀等作物生長所需的營養(yǎng)元素，如果能得到合理的利用，將會為人類帶來巨大的收益。作物秸稈的處理方式有物理、化學(xué)、生物方法，其中生物降解具有污染少、能耗低等優(yōu)點(diǎn)[1]。作物秸稈中含有豐富的纖維素，纖維素在纖維素酶的作用下可以水解生成單糖被作物和微生物利用，但纖維素不易被降解，幾十年來，人們對于纖維素的預(yù)處理及酶水解過程進(jìn)行了大量研究，其中纖維素酶的使用大大提高了纖維素的降解率[2]。

米曲霉屬半知菌亞門絲孢綱絲孢目從梗孢科曲霉屬真菌中的一個常見種。米曲霉（Aspergillus oryzae）是纖維素酶的主要生產(chǎn)菌種之一。工業(yè)用米曲霉菌種所產(chǎn)的酶系較多、酶系組成較復(fù)雜[3]，國內(nèi)對該菌株的相關(guān)研究并不多，對其酶系在工業(yè)發(fā)酵過程中受到的影響因素及其作用機(jī)理并不十分了解，從而導(dǎo)致在工業(yè)生產(chǎn)過程中不能夠十分精確地控制米曲霉的產(chǎn)酶過程，限制了這一傳統(tǒng)的食用菌株在工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域的進(jìn)一步拓展[4]。本試驗(yàn)對米曲霉M1102產(chǎn)纖維素酶在固體發(fā)酵過程中所受的影響及活性變化進(jìn)行了研究，以期為米曲霉產(chǎn)纖維素酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供相關(guān)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌種。米曲霉菌株M1102，來自中國菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基與主要試劑。斜面培養(yǎng)基：土豆培養(yǎng)基（PDA）；液體種子培養(yǎng)基：豆餅粉5 g/L，蛋白胨5 g/L，蔗糖10 g/L，MgSO4 0.3 g/L，K2HPO4 0.3 g/L，調(diào)節(jié)pH值至7.0；營養(yǎng)鹽溶液：NaCl 2 g/L、KH2PO4 1.5 g/L、CaCO3 0.5 g/L、MgSO4 0.5 g/L，調(diào)節(jié) pH值至7.0；固體培養(yǎng)基：木質(zhì)纖維素培養(yǎng)基；主要試劑：麩皮、稻殼粉、玉米粉、玉米芯粉、葡萄糖、蔗糖、豆餅粉、干酪素、蛋白胨、硫酸銨、尿素。

1.1.3 儀器設(shè)備。酒精燈、接種環(huán)、超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、pH測定儀、紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、控溫?fù)u床。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法。一是米曲霉種子液制備：將米曲霉接種于PDA斜面上進(jìn)行活化，用接種環(huán)挑取一環(huán)接種于250 mL三角瓶的種子液中，裝液量為50 mL，30 ℃，180 r/min，培養(yǎng)24 h。二是固體培養(yǎng)：在250 mL三角瓶中加入10 g風(fēng)干后過篩的木質(zhì)纖維原料和5 mL營養(yǎng)鹽溶液，拌勻，121 ℃滅菌30 min，冷卻后將種子液以3%的接種量接種于固體培養(yǎng)基中，32 ℃下培養(yǎng)60 h，測定其產(chǎn)纖維素酶活[5]。粗酶液的制備：每1g固態(tài)培養(yǎng)物加入磷酸緩沖溶液5.0 mL（pH值 7.2），室溫下浸提1 h，10 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。

1.2.2 培養(yǎng)條件的優(yōu)化。一是碳源對纖維素酶活的影響：分別用3%含量的麩皮、稻殼粉、玉米粉、玉米芯粉、葡萄糖、蔗糖作為培養(yǎng)基的碳源，其他成分同初始培養(yǎng)基，培養(yǎng)結(jié)束后測定其纖維素酶含量[6]。二是氮源對纖維素酶活的影響：分別以2%的豆餅粉、干酪素、蛋白胨、硫酸銨、尿素作為培養(yǎng)基的氮源，其他成分同初始培養(yǎng)基，培養(yǎng)結(jié)束后測定培養(yǎng)基中纖維素酶含量[6]。三是發(fā)酵條件優(yōu)化：采用優(yōu)化后的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，在固定其他發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，逐一對發(fā)酵培養(yǎng)的初始pH值、培養(yǎng)基含水量、培養(yǎng)時間、發(fā)酵溫度等培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.3 纖維素酶活的測定方法。采用GB-羧甲基纖維素法（CMC法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基碳源對纖維素酶活力的影響

酶誘導(dǎo)物和酶蛋白質(zhì)前體同時對纖維素酶的合成有調(diào)控作用，酶誘導(dǎo)物一般為可利用的碳源，纖維素作為酶誘導(dǎo)物對纖維素酶的產(chǎn)生有重要作用。從圖1可以看出，在培養(yǎng)基其他基礎(chǔ)營養(yǎng)成分不變的前提下，改變碳源含量后，米曲霉產(chǎn)纖維素酶活發(fā)生顯著變化，其中碳源為麩皮時纖維素酶活最高；稻殼粉和玉米芯粉次之，為最高酶活的72%和68%；玉米粉和蔗糖為最高酶活的60%和37%；碳源為葡萄糖時纖維素酶活最低，僅為最高酶活的30%。當(dāng)碳源中纖維素含量豐富時，米曲霉產(chǎn)纖維素酶活力高，這是由于纖維素作為酶誘導(dǎo)物能刺激纖維素酶的產(chǎn)生，將其分解為可利用的單糖，而葡萄糖和蔗糖作為碳源時，米曲霉能直接利用其作為碳源，所以抑制了纖維素酶的產(chǎn)生。

2.2 培養(yǎng)基氮源對纖維素酶活力影響

氮源是酶蛋白質(zhì)前體的主要來源，因此氮源的類型和性質(zhì)同樣會影響纖維素酶的合成和分泌。選擇不同氮源作為單一氮源進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，來考察其對米曲霉產(chǎn)酶的影響。

從圖2可以看出，在試驗(yàn)選用的5種有機(jī)和無機(jī)氮源中，以豆餅粉作為氮源時米曲霉所產(chǎn)纖維素酶活性最高；干酪素和蛋白胨次之，纖維素酶活是豆餅粉作為單一氮源時活性的96%和81%；當(dāng)分別以硫酸銨和尿素為單一氮源時，米曲霉所產(chǎn)纖維素酶活性僅為最高酶活性的70%和68%。由此表明，有機(jī)氮源對纖維素酶活的影響大于無機(jī)氮源，這可能與有機(jī)氮源中營養(yǎng)成分含量多元化有關(guān)。

2.3 培養(yǎng)基初始pH值對纖維素酶活力的影響

微生物在生長繁殖和代謝過程中，由于營養(yǎng)物質(zhì)被分解利用和代謝產(chǎn)物的形成與積累，導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值發(fā)生變化，而培養(yǎng)基初始pH值不僅影響微生物的生長繁殖，且對其產(chǎn)酶情況有顯著的影響。在優(yōu)化培養(yǎng)基碳氮源基礎(chǔ)上，調(diào)節(jié)初始pH值為4.0～9.0來考察米曲霉產(chǎn)酶活性的變化。從圖3 可以看出，米曲霉產(chǎn)生纖維素酶的最佳初始pH 值為6.0～7.5，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為5.5，米曲霉仍能產(chǎn)生相對于最高活性 72%的纖維素酶；而當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值調(diào)至8.0 時，米曲霉產(chǎn)生纖維素酶活性則迅速下降至最高酶活性的34%。試驗(yàn)表明米曲霉產(chǎn)纖維素酶的pH值適應(yīng)范圍較寬，但過酸或過堿的環(huán)境不利于纖維素酶的生產(chǎn)。這可能是由于過酸或過堿的環(huán)境不利于米曲霉生長或破壞了纖維素酶活力。

2.4 培養(yǎng)基含水量對纖維素酶活力的影響

水分是微生物生長代謝的重要物質(zhì)，在固體發(fā)酵中，水分對微生物活性有重要影響。從圖4可以看出，隨著培養(yǎng)基中含水量的增加，米曲霉產(chǎn)纖維素酶活呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，當(dāng)培養(yǎng)基含水量為50%時，纖維素酶活最高。所以含水量過高或過低都會抑制米曲霉生長，這可能是由于低水分使米曲霉培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)溶解性降低，抑制了米曲霉生長；當(dāng)水分含量過高時，培養(yǎng)基過于黏稠，破壞了培養(yǎng)基的多孔結(jié)構(gòu)，降低了其透氣性，而米曲霉是耗氧微生物，低氧環(huán)境不利于其生長。

2.5 培養(yǎng)溫度對纖維素酶活力的影響

微生物最適宜的溫度范圍一般為16～30 ℃，最高溫度在37～43 ℃，溫度過高或過低均不利于米曲霉生長。從圖5可以看出，在30～35 ℃時，纖維素酶活最高，溫度過低或過高都會降低纖維素酶活。這是由于，當(dāng)溫度過低時，米曲霉生

長緩慢導(dǎo)致產(chǎn)生纖維素酶少，而且低溫環(huán)境會降低酶活力；當(dāng)溫度過高時，米曲霉會由于高溫而出現(xiàn)老化現(xiàn)象，抑制了纖維素酶產(chǎn)生，并且高溫容易使纖維素酶失活。

2.6 培養(yǎng)時間對纖維素酶活力的影響

微生物處于不同的生長期時，其相應(yīng)的生長代謝機(jī)理也不同。從圖6可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，米曲霉產(chǎn)纖維素酶活呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)培養(yǎng)至60 h時，纖維素

酶活最高。這是由于培養(yǎng)初期米曲霉處于繁殖階段，產(chǎn)生孢子數(shù)量有限，故分泌的纖維素酶少；而在培養(yǎng)后期，由于米曲霉出現(xiàn)老化，導(dǎo)致纖維素酶分泌量減少。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了米曲霉菌株M1102在不同固體發(fā)酵條件下產(chǎn)纖維素酶的變化。結(jié)果表明：當(dāng)碳源為麩皮，氮源為豆餅粉，初始pH值為6.5，含水量為50%，培養(yǎng)溫度為30 ℃，培養(yǎng)時間為60 h時，米曲霉產(chǎn)纖維素酶活力最高。為了深入了解米曲霉固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的影響因素，還需要對纖維素酶的生產(chǎn)條件和作用機(jī)理做更深一步的研究。

4 參考文獻(xiàn)

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