IL-10基因多態性及血清水平與顱內動脈瘤發病的關系

邵得明，邱虹，于向東，馬向輝，李云超，王玉玨

IL-10基因多態性及血清水平與顱內動脈瘤發病的關系

邵得明1，邱虹2，于向東2，馬向輝1，李云超2，王玉玨2

目的分析白細胞介素（IL）-10基因啟動子區-1082G/A、-819C/T單核苷酸多態性（SNP）及血清IL-10水平與顱內動脈瘤（IAs）發病的關系。方法運用PCR及DNA直接測序的方法，檢測206例IAs患者（IAs組）和187例非IAs患者（對照組）的IL-10基因啟動子區SNP位點，-1082G/A、-819C/T的基因型頻率和等位基因頻率，χ2檢驗分析IAs組和對照組之間的差異；采用ELISA法檢測血清中IL-10水平，t檢驗分析2組之間的差異。結果IL-10基因啟動子區-1082G/A位點的GG基因型和GA+AA基因型，以及G等位基因和A等位基因頻率比較，IAs組較對照組GA+AA基因型以及A等位基因頻率更高，差異均有統計學意義（P＜0.01），GA+AA基因型（OR值為4.137，95%CI 2.476～6.914）和A等位基因（OR值為3.368，95%CI 2.476～4.583）攜帶者有更高的IAs發病風險；IL-10基因啟動子區-819C/T位點的CC基因型和CT+TT基因型以及C等位基因和T等位基因頻率比較，IAs組較對照組CT+TT基因型以及T等位基因頻率更高，差異均有統計學意義（P＜0.01），CT+TT基因型（OR值為3.393，95% CI 1.952～5.900）和T等位基因（OR值為3.764，95%CI 2.730～5.192）攜帶者有更高的IAs發病風險。IAs組血清IL-10水平低于對照組（P＜0.01）。結論IL-10基因啟動子區SNP影響IL-10表達，IL-10基因啟動子區-1082G/A、-819C/T多態性與IAs的發病有關。

顱內動脈瘤；白細胞介素10；單核苷酸多態性

顱內動脈瘤（intracranial aneurysms，IAs）是指顱內動脈管壁局部的異常擴張，其首次破裂發生蛛網膜下腔出血（SAH）后致殘率和致死率均可高達33%［1］。目前認為IAs是由多種環境因素和多個基因共同作用而引發的多基因疾病［2］。炎性細胞因子相關基因單核苷酸多態性（SNP）與IAs發病的關系研究已有文獻報道［3］。白細胞介素（IL）-10是體內重要的抑炎性細胞因子，本研究旨在探尋IL-10基因多態性及其血清水平

與IAs發病的關系。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2013年5月—2015年8月在唐山市開灤總醫院和河北省遷安市人民醫院神經外科住院治療的IAs患者206例（IAs組），以同期住院的187例非IAs患者作為對照組。IAs組動脈瘤破裂致SAH者143例，多發動脈瘤76例。所有IAs組患者均通過全腦血管造影（DSA）確診為顱內囊性動脈瘤；均為散發性病例，無IAs家族史，排除動靜脈畸形、馬凡綜合征、常染色體顯性遺傳性多囊腎病（ADPKD）等。對照組均經磁共振血管成像（MRA）、CT血管造影（CTA）或DSA檢查排除IAs；所有研究對象均無動脈瘤及SAH家族史，無卒中病史，無遺傳性結締組織病史，彼此無親緣關系，均為唐山地區漢族人，且均知情同意。2組臨床資料比較差異均無統計學意義，見表1。

Tab.1Comparison of clinical information between two groups表1　2組臨床資料比較

1.2方法

1.2.1PCR檢測IL-10基因SNP位點-1082G/A、-819C/T的基因型分布采集393例研究對象的空腹肘正中靜脈血5 mL，提取基因組DNA。應用美國Applied Biosystems公司生產的GeneAmp?PCR 9700型基因擴增儀進行PCR反應，由國家人類基因組北方研究中心ABI 3730XL型DNA測序儀進行DNA直接測序，并由相應軟件平臺發現IL-10基因啟動子區SNP位點，-1082G/A和-819C/T的基因型和等位基因頻率。-1082G/A引物上游5′-GATGAATACCCAAGAC TTCTCC-3′，下游5′-GATGAGTGATTTGCCCTGA-3′；-819C/T引物上游5′-GGCACTGGTGTACCCTTGTA-3′，下游5′-CATGACCCCTACCGTCTCTATTTT-3′。反應條件：95℃預變性5 min；94℃變性40 s，63℃退火30 s，72℃延伸1 min，40個循環；72℃延伸5 min。所有PCR相關試劑均由大連寶生物工程有限公司生產。

1.2.2酶聯免疫吸附（ELISA）法測定血清IL-10水平靜脈血離心取血清，置-20℃保存。用IL-10 ELISA試劑盒（上海瑞齊生物科技有限公司）檢測人血清IL-10水平。

1.3統計學方法各位點進行Hardy-Weinberg平衡分析以檢驗樣本是否具有群體代表性，P＞0.05則認為群體基因分布符合Hardy-Weinberg平衡。用Excel軟件建立數據庫，并進行雙遍錄入，應用SPSS 19.0統計軟件進行分析。計量資料比較采用2組獨立樣本資料的t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1DNA測序結果檢測標本均成功擴增出目的片段，-1082G/A PCR產物經測序發現3種基因型：野生純合子GG基因型，雜合子GA基因型，突變純合子AA基因型，見圖1。-819C/T PCR產物經測序發現3種基因型：野生純合子CC基因型，雜合子CT基因型，突變純合子TT基因型，見圖2。

Fig.1Sequencing results of genotypes in IL-10-1082G/A圖1　IL-10-1082G/A基因型測序結果

Fig.2Sequencing results of genotypes in IL-10-819C/T圖2　IL-10-819C/T基因型測序結果

2.2Hardy-Weinberg平衡檢驗結果-1082G/A IAs組（χ2=0.28，P=0.61），對照組（χ2=1.35，P= 0.26）；-819C/T IAs組（χ2=2.78，P=0.11），對照組（χ2= 0.25，P=0.55），本研究樣本符合Hardy-Weinberg平衡。

2.3SNP位點基因型和等位基因頻率與IAs發病的關系與對照組比較，IAs組-1082G/A位點GA+AA基因型比例、A等位基因頻率更高，-819C/ T位點CT+TT基因型比例、T等位基因頻率更高，差異有統計學意義（P＜0.01）；且-1082G/A位點GA+ AA基因型、A等位基因以及-819C/T位點CT+TT基因型、T等位基因罹患IAs的危險性明顯增高，見表2、3。

2.42組血清IL-10水平比較IAs組及對照組血清IL-10水平分別為（10.0±2.2）ng/L和（18.2±1.8）ng/L，IAs組較對照組明顯降低（t=40.540，P＜0.01）。

Tab.2Polymorphism distribution of IL-10-1082G/A in IAs group and control group表2　IAs組與對照組IL-10-1082G/A位點的多態性分布例（%）

Tab.3Polymorphism distribution of IL-10-819C/T in IAs group and control group表3　IAs組與對照組IL-10-819C/T位點的多態性分布例（%）

3　討論

IAs破裂引起的SAH是嚴重的腦血管事件，其后果為1/3死亡，1/3遺留嚴重神經功能障礙，另1/3好轉［4］。而社區人群影像學篩查的IAs檢出率僅為0.2%～1.8%［5］。越來越多的證據表明，免疫炎性反應與IAs的形成密切相關［6-7］。最近的病理學研究發現，IAs瘤壁組織平滑肌細胞減少或消失，纖維組織增生明顯，動脈壁中膜及外膜可見有大量巨噬細胞和淋巴細胞浸潤［8］。聚集的炎癥細胞會分泌多種促炎性細胞因子，如IL-6和腫瘤壞死因子（TNF）-α等，繼而發揮致炎作用［9］。炎性細胞因子及其基因多態性與IAs的關系已成為研究熱點。

IL-10是一種多效性的細胞因子，其能抑制Th1細胞、NK細胞等合成分泌IL-1β、TNF-α、干擾素γ等炎性細胞因子，下調細胞免疫反應，還能通過下調MHCⅡ類抗原與CD54、CD80等協同刺激分子的表達，削弱其抗原呈遞能力，從而抑制炎癥反應。有研究表明，IL-10基因轉錄起始部位上游啟動子區域-1082G/A、-819C/T、-592C/A處有3個SNP位點［10］，其與IL-10基因的轉錄活性及血清IL-10水平有關［11］，即-1082G/A、-819C/T不同的等位基因改變了基因轉錄及翻譯過程，-1082G、-819C、-592C與IL-10的高表達有關，而-1082A、-819T、-592A則與IL-10的低表達有關。研究表明，IL-10-819位點與-592位點等位基因緊密連鎖［12］，故本研究選取-1082G/A、-819C/T為靶點。IL-10基因多態性與某些疾病的易感性有關，Vinod等［13］報道，在南印度人群中，IL-10-1082G/A位點AA基因型是乳腺癌的危險因素，相對于GA基因型，AA基因型與乳腺癌的發病有關（OR=2.854，95%CI 1.68～4.849）。

本研究結果顯示，與對照組相比，IAs組-1082位點A等位基因、-819位點T等位基因頻率更高，且IAs組血清IL-10水平顯著降低。因此，IL-10基因啟動子區-1082G/A、-819C/T位點SNP可能與唐山地區漢族人IAs的發病有關；-1082G/A位點A等位基因攜帶者、-819C/T位點T等位基因攜帶者可能增加IAs的發病風險。其可能機制為：IL-10 -1082A等位基因及-819T等位基因直接影響轉錄因子EtsY與該序列DNA的結合，使之不能結合EtsY從而抑制轉錄，IL-10基因的表達下降，因而IL-10的血清水平降低。IL-10的減少則不能抑制TNF-α等促炎性細胞因子生成，隨著TNF-α水平的不斷增加，導致血管內皮細胞功能障礙，引起包括巨噬細胞在內的炎性細胞滲入動脈壁參與炎性反應。巨噬細胞在IAs瘤壁破壞性重建中的具有至關重要的作用［14］，其可以釋放一氧化氮，增強炎性反應，并引起平滑肌細胞凋亡，最重要的一個作用是分泌基質金屬蛋白酶-9，直接導致膠原蛋白和彈性蛋白降解，分解細胞外基質，破壞動脈壁結構，在血流動力學改變等共同作用下，誘導動脈瘤的形成。反之，IL-10-1082G等位基因及-819C等位基因攜帶者的基因表達增加，血漿IL-10水平相對較高，炎癥抑制效應明顯，對血管壁有保護作用，降低了IAs的發病風險。

本研究為IAs的病因及發病機制研究提供了一個新的方向，有助于進一步地深入研究以及對高危人群進行早期基因干預，但尚需在多種族、大樣本研究中得到驗證。

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（2015-12-30收稿2016-04-11修回）

（本文編輯李國琪）

The relationship between gene polymorphism and serum expression of interleukin-10 with intracranial aneurysm

SHAO Deming1，QIU Hong2，YU Xiangdong2，MA Xianghui1，LI Yunchao2，WANG Yujue2
1 Department of Neurosurgery，Qian'an People's Hospital，Qian'an 064400，China；2 Department of Neurosurgery，Kailuan General Hospital

ObjectiveTo analyze the associations of the interleukin-10（IL-10）promoter-1082G/A and-819C/T single nucleotide polymorphism（SNP）and serum level of IL-10 with intracranial aneurysm（IAs）.MethodsThe polymerase chain reaction（PCR）and DNA direct sequencing methods were used to detect IL-10 gene promoter district two SNP site，-1082G/A and-819C/T genotype frequency and allele frequency in 206 patients with IAs and 187 controls.Chisquare test was used to analyze differences between two groups.The serum level of IL-10 was analyzed by ELISA，and ttest was used to analyze significant differences between two groups.ResultsThere were significant differences in genotypes of GG and GA+AA，as well as the alleles G and A，in-1082G/A locus between IAs group and control group（P＜0.01）.There were higher frequencies of genotype GA+AA and the allele A in IAs group than those in control group（P＜0.01）.There was higher risk of suffering IAs in patients with genotype GA+AA（OR=4.137，95%CI:2.476-6.914）and the allele A（OR=3.368，95%CI:2.476-4.583）.There were higher frequencies of the genotype CT+TT and the allele T in-819C/ T locus in IAs group than those of control group（P＜0.01）.There was higher risk of suffering IAs in patients with genotype CT+TT（OR=3.393，95%CI:1.952-5.900）and the allele T（OR=3.764，95%CI:2.730-5.192）.The serum level of IL-10 was significantly lower in IAs group than that of control group（P＜0.01）.ConclusionThe IL-10 promoter SNP influences the expression of IL-10.IL-10 promoter-1082G/A and-819C/T polymorphisms are correlated with the formation of IAs.

intracranial aneurysms；interleukin-10；single nucleotide polymorphism

R651.1+2

A

10.11958/20160003

1河北省遷安市人民醫院神經外科（郵編064400）；2開灤總醫院神經外科

邵得明（1979），男，主治醫師，碩士研究生，主要從事腦血管病的基礎研究