炎癥因子對非PCOS患者顆粒細胞活性氧水平及線粒體DNA拷貝數的影響

張暄琳，李毅，劉麗，張文靜，孟祥烔，徐鳳琴

炎癥因子對非PCOS患者顆粒細胞活性氧水平及線粒體DNA拷貝數的影響

張暄琳，李毅，劉麗，張文靜，孟祥烔，徐鳳琴△

目的探討炎癥因子對非多囊卵巢綜合征（PCOS）患者顆粒細胞活性氧（ROS）水平及線粒體DNA（mtDNA）的影響。方法選擇體外受精-胚胎移植（IVF-ET）治療的非PCOS患者50例，提取卵泡液中顆粒細胞進行體外培養，隨機分為炎癥因子處理組和對照組，處理組分別加入5 nmol/L的炎癥因子白細胞介素（IL）-1、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α，對照組加入等量炎癥因子稀釋液，比較各組顆粒細胞ROS水平及mtDNA拷貝數是否存在差異。結果IL-1、IL-6、TNF-α處理組顆粒細胞ROS水平及mtDNA拷貝數均顯著高于對照組（均P＜0.05）。結論炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α可導致顆粒細胞氧化應激水平增高和線粒體受損。

白細胞介素類；腫瘤壞死因子α；活性氧；DNA，線粒體；顆粒細胞

多囊卵巢綜合征（PCOS）、子宮內膜異位癥及部分免疫性不孕患者體內炎癥因子，如白細胞介素（IL）-1、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α水平高于正常人群［1］。近年來研究發現慢性炎癥反應影響女性生殖健康，高水平炎癥因子降低卵母細胞質量，降低妊娠率［2］。另有研究顯示氧化應激在PCOS等不孕癥相關疾病的發病機制中起著關鍵的作用［3］，氧化應激過程產生的活性氧（ROS）可損傷線粒體，引起線粒體DNA（mtDNA）拷貝數的改變，嚴重者可引起細胞凋亡［4］。顆粒細胞對卵母細胞的發育、成熟起重要的調控作用，影響卵泡啟動、發育、成熟及閉鎖的全過程，顆粒細胞受損會降低卵母細胞的質量及胚胎發育潛能［5］。目前關于慢性炎癥狀態是否對顆粒細胞產生影響尚不完全清楚。本研究旨在探討炎癥因子是否影響顆粒細胞ROS及mtDNA拷貝數，進一步明確高炎性狀態與不孕的關系。

1　對象與方法

1.1研究對象選擇2014年5月—2015年5月于我科接受體外受精-胚胎移植（IVF-ET）治療的非PCOS患者50例。納入標準：患者年齡＜35歲，月經周期規律（25～35 d），基礎內分泌檢查無異常。排除甲狀腺疾病、腎上腺疾病及其他可能影響內分泌系統的疾病，超聲檢查排除多囊卵巢、子宮內膜異位改變，所有患者均知曉并自愿簽署知情同意書。

1.2超促排卵方案所有患者均采用長方案超促排卵。于排卵后5～7 d每日皮下注射促性腺激素釋放激素激動劑GnRH-a（商品名達必佳，輝凌制藥有限公司）0.05～0.10 mg。14～16 d后患者血清雌二醇≤50 ng/L，促卵泡激素（FSH）≤5 IU/L，黃體生成素（LH）≤5 IU/L，陰道B超監測子宮內膜厚度≤5 mm，多個卵泡直徑≤5～8 mm時，達到降調標準后給予促性腺激素（Gn）促排卵，根據卵泡發育情況調整劑量。當1個卵泡平均直徑超過18 mm或2個卵泡平均直徑超過17 mm或3個卵泡平均直徑超過16 mm時給予人絨毛膜促性腺激素（HCG）10 000 U肌內注射，36 h后取卵。

1.3顆粒細胞的提取留取所有卵泡液，將液體以2 000 r/min離心5 min，棄上清液。剩余細胞沉淀物重懸于DMEM/F12培養液（美國Gibco公司），以2∶3體積比將細胞懸液移至體積分數45%Percoll分離液（美國Sigma公司）的表面，以2 000 r/min離心20 min。吸出位于界面處的顆粒細胞層，加入5倍體積的PBS，1 000 r/min離心3 min后棄上清。加入等體積10%透明質酸酶消化1.5 min，用2倍體積含FBS（美國Gibco公司）的DMEM/F12培養液終止消化。再次用PBS洗滌細胞，用DMEM/F12培養液重懸細胞。

1.4顆粒細胞的培養取0.1 mL細胞懸液加等量臺盼藍（美國Sigma公司）染色，檢測存活細胞在75%以上。血球計數板計算細胞濃度，調整細胞濃度為6×104/mL密度接種于12孔培養板，每孔內含1 mL培養液。每例患者接種4板，隨機編號為1、2、3、4號，其中1號為IL-1組，2號為IL-6組，3號為TNF-α組，4號為對照組。1、2、3號分別加入IL-1、IL-6及TNF-α（IL-1、IL-6、TNF-α購自ProSpec公司，用18 MΩ·cm水稀釋）至培養液中炎癥因子濃度為5 nmol/L，4號加入等量18 MΩ·cm水。置于37℃、體積分數5%CO2培養箱中培養。每24 h換液1次，144 h后用PBS沖洗顆粒細胞，待測。

1.5顆粒細胞內ROS的測定應用ROS檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所）檢測顆粒細胞內ROS水平。炎癥因子處理組與對照組分別加入10 μmol/L的DCFH-DA 200 μL，置于37℃的細胞培養箱內避光孵育30 min，用PBS洗3遍。用流式細胞儀檢測熒光強度。

1.6顆粒細胞mtDNA拷貝數測定按DNA提取試劑盒（TAKARA公司）說明提取DNA，首先制備mtDNA標準品并梯度稀釋后制作標準曲線。采用Real-time PCR檢測炎癥因子處理組與對照組中顆粒細胞線粒體DNA拷貝數ND1（mtDNA管家基因）。ND1片段為mtDNA高度保守序列，可反映mtDNA的總量。應用ABI PRISM7900H T實時熒光定量PCR擴增儀（Applied Biosysterms）檢測mtDNA拷貝數。運用Sequence Detector Systems Version 2.0軟件（Applied Biosystems）進行數據處理。ND1基因擴增引物：上游5′-GGCTACATACAATTACGCAAAG-3′，下游5′-TAGAATGGA GTAGACCGAAAGG-3'，目的片段長度221 bp。β-actin引物擴增片段：上游5′-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3′，下游5′-CAACTTCATCCACGTTCACC-3′，目的片段長度110 bp。擴增條件：95℃預變性10 s，95℃變性5 s，61℃退火30 s，共40個循環。

1.7統計學方法采用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1入組患者一般情況50例患者平均年齡（29.65±0.67）歲，體質指數（22.38±0.22）kg/m2，基礎內分泌：FSH（6.18±0.24）IU/L，LH（3.65±0.39）IU/L，睪酮（0.79±0.08）nmol/L。基礎竇卵泡數（9.50±5.26）個。Gn使用時間（14.20±1.20）d，Gn劑量（2 249.40± 245.70）IU。發育卵泡數（7.12±4.08）個，獲卵數（6.02±4.62）個。

2.2炎癥因子對顆粒細胞ROS水平的影響炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α處理組的ROS水平和mtDNA拷貝數均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

Tab.1The level of ROS and copy number of mtDNA in granulosa cells in treatment group and control group表1　炎癥因子處理組與對照組顆粒細胞的ROS及mtDNA拷貝數

Tab.1The level of ROS and copy number of mtDNA in granulosa cells in treatment group and control group表1　炎癥因子處理組與對照組顆粒細胞的ROS及mtDNA拷貝數

＊P＜0.05；a與對照組比較，P＜0.05

組別n ROS（ng/mL）mtDNA拷貝數（copy/μg，×105）對照組IL-1組IL-6組TNF-α組F 91 2 14 15 1.00±0.89 3.64±0.43a 4.13±0.65a 3.98±0.65a 26.387＊4.00±0.62 6.32±0.99a 6.84±1.02a 5.99±0.89a 31.316＊

3　討論

PCOS是不孕癥的常見病因之一，研究證實患PCOS、子宮內膜異位癥等疾病的女性體內炎癥因子水平普遍高于正常人群［1］，在IVF-ET治療時表現為卵子及胚胎質量下降、妊娠率低而流產率高等特點。近年來慢性炎癥反應對女性生殖健康的影響越來越受到關注。Ebejer等［6］認為PCOS患者妊娠率低可能與體內炎癥因子導致卵巢功能障礙有關，但具體的作用機制尚不十分清楚。另有研究表明PCOS患者卵丘顆粒細胞凋亡率較非PCOS患者明顯升高，卵母細胞質量降低與卵泡內顆粒細胞代謝功能異常及過度凋亡有關［7］。為了探討PCOS患者體內高炎癥狀態是否影響顆粒細胞的代謝功能，從而尋找導致PCOS患者卵子及胚胎質量下降的可能因素，本研究選擇非PCOS患者IVF-ET后卵泡液中的顆粒細胞體外培養，于培養液中添加炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α模擬機體內慢性炎癥狀態對顆粒細胞的影響，從ROS及線粒體方面分析慢性炎癥狀態下顆粒細胞正常生理狀態是否發生改變。

ROS是炎癥反應的效應器，近年來多項研究發現，ROS在不孕癥的發病機制中起著關鍵的作用。ROS啟動竇卵泡顆粒細胞凋亡［8］，誘發小鼠卵母細胞減數分裂中非整倍體形成［3］。Elizur等［9］研究認為卵泡液中ROS水平降低時，胚胎質量更高。本研究添加炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α后體外培養顆粒細胞，結果提示炎癥因子處理組顆粒細胞中ROS水平均顯著高于對照組，這可能與炎癥因子水平升高打破機體內ROS產生與清除的動態平衡有關［3］。另外，IL-1通過促進胰島B細胞的一氧化氮生成和細胞凋亡而引起B細胞選擇性的破壞［10］；IL-6通過抑制胰島素介導的脂肪合成、葡萄糖的轉運及抑制胰島素信號傳導［1］；TNF-α通過促進脂肪分解引起血漿游離脂肪酸水平增高［2］，導致胰島素抵抗的發生，過剩的糖類物質和游離脂肪酸氧化產生ROS，引發氧化應激［11］，過多的ROS累積損傷顆粒細胞。

另外大量研究證實線粒體與卵母細胞成熟、胚胎發育密切相關，使用影響線粒體生成的藥物處理成熟期小鼠后，卵子質量下降，線粒體移植可以改善IVF妊娠結局［12］。mtDNA拷貝數提示線粒體功能水平，當線粒體受損時通過提高mtDNA拷貝數以代償減弱的線粒體呼吸功能［4］。本研究結果顯示，3種炎癥因子處理組顆粒細胞mtDNA拷貝數均顯著高于對照組，提示高水平炎癥因子損傷顆粒細胞內線粒體功能。這可以用經典的“ROS-線粒體損傷學說”解釋，細胞內ROS累積破壞mtDNA，而mtDNA的損傷又會加劇ROS堆積，形成惡性循環［4］，提示高炎癥狀態影響線粒體正常呼吸功能，導致ROS累積，ROS加劇線粒體損傷，導致mtDNA拷貝數代償性增加。mtDNA缺乏組蛋白保護，較易發生基因變異，導致線粒體的能量代謝出現異常，影響顆粒細胞的正常生理功能，誘發顆粒細胞的凋亡。而顆粒細胞在雌激素合成、卵泡發育及卵子成熟上起重要作用。這可能是PCOS患者卵子及胚胎質量下降、妊娠率下降而流產率增高的因素之一，因此PCOS患者在進行IVF-ET前改善高炎癥狀態對改善患者的妊娠結局至關重要。

本研究初步解釋了機體處于慢性炎癥狀態與顆粒細胞功能受損之間的關系。目前關于慢性炎癥反應與女性不孕癥關系的研究尚處于起步階段，炎癥因子是否影響卵巢微環境、不同炎癥因子濃度下顆粒細胞生理功能是否存在差異、抗炎藥物及抗氧化劑對提高IVF-ET成功率是否存在幫助等一系列問題，仍需進一步研究。

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（2016-01-09收稿2016-04-12修回）

（本文編輯魏杰）

Effects of inflammatory markers on the level of reactive oxygen species and mitochondria DNA copy numbers in granulosa cells of patients without PCOS

ZHANG Xuanlin，LI Yi，LIU Li，ZHANG Wenjing，MENG Xiangtong，XU Fengqin△
Department of Reproductive，Tianjin First Center Hospital，Tianjin 300192，China△

E-mail：xufengqin1968@126.com

ObjectiveTo study the effect of inflammatory markers on the level of reactive oxygen species（ROS）and mitochondrial DNA（mtDNA）copy numbers in granulosa cells of patients without polycystic ovary syndrome（PCOS）. MethodsFifty patients without PCOS treated with in vitro fertilization and embryo transfer（IVF-ET）were selected in this study.The granulosa cells were extracted and cultured in vitro.Cells were randomly divided into treatment group and control group.The 5 nmol/L interleukin（IL）-1，IL-6 and tumor necrosis factor（TNF）-α were given to treatment group，and same amount of inflammatory diluted solution was added to control group.The levels of ROS and copy numbers of mtDNA were compared between two groups.ResultsThe ROS levels and mtDNA copy number of granulosa cells were significantly higher in IL-1，IL-6 and TNF-α treatment groups than those of control group（P＜0.05）.ConclusionInflammatory markers of IL-1，IL-6 and TNF-α increase the level of ROS and damage mtDNA in granulosa cells.

interleukins；tumor necrosis factor-alpha；reactive oxygen species；DNA，mitochondrial；granulosa cells

R711.6

A

10.11958/20160013

天津市衛生局科技基金（2013KZ033）

天津市第一中心醫院生殖醫學科（郵編300192）

張暄琳（1989），女，碩士，主要從事生殖醫學研究

E-mail：xufengqin1968@126.com