Nfic基因3′UTR雙熒光素酶報告質粒的構建及其與miR-20a靶向關系的驗證

王珊，李曉霞，周杰，王寶利△

Nfic基因3′UTR雙熒光素酶報告質粒的構建及其與miR-20a靶向關系的驗證

王珊1，2，李曉霞2，周杰1，王寶利1△

目的構建核因子C（nuclear factor I-C，Nfic）基因3′非編碼區（3′UTR）熒光素酶報告質粒，利用雙熒光素酶報告基因驗證microRNA-20a（miR-20a）與其潛在靶基因Nfic的靶向關系。方法通過microRNA靶基因預測軟件Targetscan獲取miR-20a與Nfic基因3′UTR潛在的互補結合位點；PCR擴增出Nfic基因3′UTR序列，將此序列克隆至熒光素酶報告載體pMIR-Report Luciferase；將重組熒光素酶報告質粒與miR-20a mimics（實驗組）或NC mimics（對照組）共同轉染293-AD細胞，收集細胞后通過雙熒光素酶報告系統檢測2組細胞的熒光素酶活性，從而對Nfic與miR-20a的靶向調節關系進行鑒定。將miR-20a mimics和NC mimics分別轉染骨髓基質細胞系ST2，裂解細胞提取蛋白后采用Western blotting檢測NFIC蛋白的表達水平。結果構建的重組熒光素酶報告質粒經酶切及測序鑒定正確。雙熒光素酶報告基因檢測顯示，與對照組相比，miR-20a可以抑制Nfic 3′UTR報告基因載體的熒光素酶活性（P＜0.05）；Western blotting結果顯示，與對照組相比，ST2細胞轉染miR-20a mimics后NFIC蛋白表達水平明顯下調。結論成功構建了Nfic基因3′UTR熒光素酶報告質粒，而miR-20a可以直接作用于Nfic基因3′UTR，抑制其熒光素酶活性。

微RNAs；3′非翻譯區；miR-20a；Nfic；骨髓基質細胞系；熒光素酶報告基因

microRNAs是一類約22個核苷酸組成的種類豐富且進化保守的單鏈非編碼小分子RNA，可以通過與靶基因mRNA完全互補配對而降解mRNA，或者與mRNA的3′非編碼區（3′untranslated region，3′UTR）部分互補配對而阻斷蛋白質翻譯，從而實現基因表達的轉錄后調控［1-2］。本課題組前期研究證明microRNA-20a（miR-20a）可以通過靶向Kdm6b促進間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）向成脂分化［3］。也有研究證實核因子C（nuclear factor I-C，Nfic）在骨髓MSCs向成骨細胞分化和骨形成中起著重要作用［4］。通過生物信息學預測發現Nfic也是miR-20a的潛在靶基因，本研究擬采用雙熒光素酶報告基因檢測、Western blotting等分子生物學技術驗證miR-20a和Nfic之間的靶向關系，為進一步闡明miR-20a調節成骨分化的分子機制奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料細胞株293-AD及骨髓基質細胞系ST2細胞為本實驗室保存；SPF級4周齡雄性C57小鼠購自軍事醫學科學院；胎牛血清及細胞培養基均購自Gibco公司；轉染試劑Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司；miR-20a mimics及其陰性對照片段（NC mimics）由上海吉瑪生物科技公司合成；鼠源NFIC單克隆抗體購自Immunoway公司；鼠源β-actin單克隆抗體購自proteintech公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG購自中杉金橋公司；雙熒光素酶檢測試劑盒、pMIR-Report Luciferase購自Promega公司；pEasy-T1購自北京Transgene公司。

1.2方法

1.2.1構建熒光素酶報告基因載體通過microRNA靶基因預測軟件Targetscan獲取miR-20a與Nfic基因3′UTR潛在的互補結合位點，設計成對PCR擴增引物，構建含有miR-20a應答序列的Nfic 3′UTR片段。Nfic引物上游5′-CTCGCACATGGAAGGTATCAG-3′，下游5′-CCACGTCATC AGGAGGGTCA-3′。

取C57小鼠1只，以小鼠肝臟DNA為模板進行PCR擴增反應，將得到的PCR產物與pEasy-T1載體進行連接，25℃連接10 min后轉化感受態細胞DH5α，均勻涂于預先涂有異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）的LB/氨芐青霉素的固體培養基上，進行藍白斑篩選。37℃過夜培養后，挑取白色單菌落搖菌過夜，提取質粒命名為Nfic-3′UTR-T1。pMIR-Report Luciferase載體經限制性內切酶HindⅢ/PmeⅠ雙酶切電泳回收大片段，Nfic-3′UTR-T1經HindⅢ/EcoRⅤ雙酶切回收小片段，其中PmeⅠ和EcoRⅤ互為同尾酶。用T4 ligase將pMIR-Report Luciferase酶切回收的大片段與Nfic-3′UTR-T1酶切回收的小片段于16℃連接過夜，轉化感受態細胞DH5α，均勻涂于LB/氨芐青霉素的固體培養基上，于固體培養板上挑取單菌落37℃搖菌過液，提取質粒命名為Nfic-Luc。用HindⅢ/SacⅠ進行雙酶切鑒定，37℃反應15 min后，進行瓊脂糖凝膠電泳。酶切鑒定正確后送測序，并將結果正確的克隆于-80℃保存。

1.2.2miR-20a與Nfic-Luc共轉染293-AD細胞用含10%FBS的DMEM培養基于37℃、5%CO2培養箱內培養。轉染前將細胞接種于24孔板中，待細胞匯合度達到40%～50%時進行轉染。miR-20a mimics（實驗組）及NC mimics（對照組）的終濃度為50 nmol/L，每孔分別加入0.5μg Nfic-Luc質粒及10 ng pRL-SV40報告基因載體。轉染試劑采用Lipofectamine 3000。

1.2.3雙熒光素酶活性檢測轉染40 h后，采用Dual-Luciferase Reporter Assay System進行檢測。吸凈各轉染孔內的培養基，并用PBS清洗細胞1次。于各孔中加入100μL細胞裂解液，經過1次凍融反應后，收集各孔中的細胞裂解液，12 000 r/min離心1 min沉淀雜質。取20μL上述細胞裂解液于不透明96孔板各孔中，按照說明書依次加入螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素酶底物，通過多功能酶標儀進行檢測。

1.2.4Western blotting實驗當ST2細胞匯合度達到40%～50%時，分別轉染NC mimics與miR-20a mimics，48 h后獲取細胞，并加入適量的細胞裂解液，提取蛋白。BCA法進行蛋白質定量。10%SDS-PAGE凝膠，恒壓電泳，恒流250 mA轉膜2 h，室溫封閉2 h，加入一抗后4℃孵育過夜，以β-actin為內參；1×TBST洗滌4次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h后，ECL化學發光法檢測分析結果。

1.3統計學方法采用SPSS 17.0統計軟件分析，計量資料以均數±標準差表示，各組間均數比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1成功構建熒光素酶報告基因載體Nfic基因3′-UTR基因片段克隆到pMIR-Report Luciferase載體中，命名為Nfic-Luc。其酶切鑒定及測序結果均顯示載體構建成功，見圖1。

2.2雙熒光素酶報告基因檢測將miR-20a mimics與Nfic-Luc熒光素酶報告基因載體共轉染293-AD細胞后，細胞熒光素酶活性顯著下降，其活性實驗組（0.56±0.03）較對照組（1.00±0.03）下降了44%，差異有統計學意義（n=3，t=17.272，P＜0.01）。

2.3Western blotting檢測miR-20a對NFIC蛋白表達水平的影響對照組和實驗組中NFIC/β-actin分別為0.76±0.04、0.36±0.01，差異有統計學意義（n=3，t=17.155，P＜0.05），見圖2。

Fig.1Nfic-Luc construction was identified by enzyme digestion圖1Nfic-Luc重組質粒雙酶切鑒定

Fig.2NFIC protein level was down-regulated after the transfection of miR-20a mimics versus control mimics transfection圖2　轉染miR-20a mimics后NFIC蛋白表達水平較對照組降低

3　討論

隨著生活水平的提高，人均壽命的延長，骨質疏松、骨關節炎等疾病的發病率越來越高。MSCs是一類能自我更新、具有多向分化潛能的非造血干細胞，可以向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等方向分化［5-6］，且在體外擴增多代后仍可保持其多向分化潛能，對于骨質疏松、股骨頭壞死等骨科疾病具有重要的臨床治療意義［7］。同時越來越多的研究表明，microRNA在MSCs向脂肪細胞和成骨細胞分化過程中起重要調節作用［8-10］。miR-17-92家族在組織和器官發育過程中不可或缺，歷來被廣泛研究，miR-20a就是其中一員。有研究顯示miR-20a在結腸直腸癌中較旁黏膜表達升高，且與淋巴結轉移和遠處轉移相關［11］；miR-20a表達增高可以使細胞外信號調節激酶（ERK）磷酸化延長，同時使異位基質細胞中幾種血管生成基因表達上調［12］。本課題組前期研究證明miR-20a可以通過靶向Kdm6b促進MSCs的成脂分化［3］。生物信息學預測結果提示，Nfic也是miR-20a的潛在靶基因。

NFI家族轉錄因子是位點特異性的DNA結合蛋白，又被稱為CTF或CAAT盒轉錄因子，主要包括NFIA、NFIB、NFIC和NFIX。Nfic缺失（Nfic-/-）鼠牙源性干細胞增殖減少，成牙本質細胞分化減弱而致磨牙根發育短小，說明Nfic對牙根形成具有關鍵調節作用；Nfic-/-鼠表現為嚴重的骨量減少，在Nfic-/-鼠的骨髓基質細胞中過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）γ的表達增加，促進其向脂肪細胞分化，減少成骨細胞分化［13］。有研究證明Nfic能直接調節成骨細胞特異性轉錄因子Osterix的表達并通過下游BMP2-Runx2信號通路起作用，影響骨髓基質細胞的成骨或成脂分化［4］。

為探究miR-20a對Nfic的調控作用，本研究首先將Nfic 3′UTR克隆到雙熒光素酶報告載體上，然后與pRL-SV40報告基因載體、miR-20a mimics或NC mimics共同轉染293-AD細胞，與對照組相比，miR-20a能與Nfic mRNA的3′UTR結合，明顯抑制報告載體的熒光素酶活性。進一步研究發現，在ST2細胞中分別轉染miR-20a mimics和NC mimics，miR-20a過表達能顯著下調NFIC蛋白水平，表明miR-20a可以負性調節NFIC蛋白表達。以上實驗證明Nfic是miR-20a的直接靶基因，提示miR-20a可能通過靶向調節Nfic的表達而控制MSCs的成骨或成脂過程，進而對骨或脂肪組織的發育產生影響。

有研究證明microRNA可以與某些成骨細胞或脂肪細胞調節基因的3′UTR結合從而抑制其表達，進而調節成骨或脂肪細胞的分化。如miR-214通過直接靶向結合激活轉錄因子4（activating transcription factor，ATF4）3′UTR，抑制成骨細胞活性，影響骨形成［14］；miR-144通過靶向調節鈣黏蛋白11（Cad-11），抑制MSCs向成骨分化［15］；miR-3077-5p和miR-705分別通過靶向同源框基因A10（HOXA10）和轉錄因子Runx2，使MSCs向脂肪細胞分化［16］；miR-142-5p可通過靶向含有WW結構域的E3泛素蛋白連接酶1（WW-domain-containing E3 ubiquitin proteinligase 1，Wwp1）提高成骨細胞活性和基質礦化［17］。本研究發現miR-20a過表達組中的熒光素酶活性較對照組下降了約44%，但仍有少量NFIC蛋白表達，表明miR-20a并未完全抑制Nfic的表達，提示還存在其他基因能夠調控Nfic。因此，后續有必要深入研究是否有其他microRNAs與miR-20a協同調控Nfic的表達。

［1］Kim VN.Small RNAs：classification，biogenesis，and function［J］. Mol Cells，2005，19（1）：1-15.

［2］Macfarlane LA，Murphy PR.MicroRNA：biogenesis，function and role in cancer［J］.Curr Genomics，2010，11（7）：537-561.doi：10.2174/138920210793175895.

［3］Zhou J，Guo F，Wang G，et al.miR-20a regulates adipocyte differentiation by targeting lysine-specific demethylase 6b and transforming growth factor-beta signaling［J］.Int J Obes（Lond），2015，39（8）：1282-1291.doi：10.1038/ijo.2015.43.

［4］Lee DS，Choung HW，Kim HJ，et al.NFI-C regulates osteoblast differentiation via control of osterix expression［J］.Stem Cells，2014，32（9）：2467-2479.doi：10.1002/stem.1733.

［5］Eskildsen T，Taipaleenm?ki H，Stenvang J，et al.MicroRNA-138 regulates osteogenic differentiation of human stromal（mesenchymal）stem cells in vivo［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108（15）：6139-6144.doi：10.1073/pnas.1016758108.

［6］Bruder SP，Jaiswal N，Haynesworth SE.Growth kinetics，selfrenewal，andtheosteogenicpotentialofpurifiedhuman mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and following cryopreservation［J］.J Cell Biochem，1997，64（2）：278-294.

［7］Dimitriou R，Jones E，Mcgonagle D，et al.Bone regeneration：current concepts and future directions［J］.BMC Med，2011，9：66. doi：10.1186/1741-7015-9-66.

［8］Li CJ，Cheng P，Liang MK，et al.MicroRNA-188 regulates agerelated switch between osteoblast and adipocyte differentiation［J］. J Clin Invest，2015，125（4）：1509-1522.doi：10.1172/JCI77716.

［9］Jeong BC，Kang IH，Hwang YC，et al.MicroRNA-194 reciprocally stimulates osteogenesis and inhibits adipogenesis via regulating COUP-TFII expression［J］.Cell Death Dis，2014，5：e1532.doi：10.1038/cddis.2014.485.

［10］Li H，Li T，Wang S，et al.miR-17-5p and miR-106a are involved in the balance between osteogenic and adipogenic differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells［J］.Stem Cell Res，2013，10（3）：313-324.doi：10.1016/j.scr.2012.11.007.

［11］Zhang GJ，Li Y，Zhou H，et al.miR20a is an independent prognostic factor in colorectal cancer and is involved in cell metastasis［J］.Mol Med Rep，2014，10（1）：283-291.doi：10.3892/ mmr.2014.2144.

［12］Lin SC，Wang CC，Wu MH，et al.Hypoxia-induced microRNA-20a expression increases ERK phosphorylation and angiogenic gene expression in endometriotic stromal cells［J］.J Clin Endocrinol Metab，2012，97（8）：E1515-E1523.doi：10.1210/jc.2012-1450.

［13］Kim TH，Bae CH，Yang S，et al.Nfic regulates tooth root patterning and growth［J］.Anat Cell Biol，2015，48（3）：188-194.doi：10.5115/acb.2015.48.3.188.

［14］Wang X，Guo B，Li Q，et al.miR-214 targets ATF4 to inhibit bone formation［J］.Nat Med，2013，19（1）：93-100.doi：10.1038/ nm.3026.

［15］Kang X，Kang F，Yang B，et al.miRNA-144 inhibiting osteogenesis of mesenchymal stem cells by targeting cadherin-11［J］.J Third Mil Med Univ，2013，35（10）：922-926.［康夏，康菲，楊波，等.miRNA-144靶向調節鈣粘蛋白11對間充質干細胞成骨分化的抑制效應［J］.第三軍醫大學學報，2013，35（10）：922-926］.

［16］Liao L，Yang X，Su X，et al.Redundant miR-3077-5p and miR-705 mediate the shift of mesenchymal stem cell lineage commitment to adipocyte in osteoporosis bone marrow［J］.Cell Death Dis，2013，4：e600.doi：10.1038/cddis.2013.130.

［17］Tu M，Tang J，He H，et al.MiR-142-5p promotes bone repair by maintaining osteoblast activity［J］.J Bone Miner Metab，2016 Apr 16.［Epub ahead of print］.

（2016-04-17收稿2016-05-12修回）

（本文編輯李國琪）

Construction of Nfic gene 3′UTR dual luciferase reporter vector and targeting verification between Nfic and miR-20a

WANG Shan1，2，LI Xiaoxia2，ZHOU Jie1，WANG Baoli1△
1 Key Laboratory of Hormones and Development（Ministry of Health），Metabolic Diseases Hospital&Institute of Endocrinology，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Basic Medical College of Tianjin Medical University△

E-mail：bliwang72@163.com

ObjectiveTo construct a luciferase reporter vector containing the 3′untranslated region（3′UTR）of nuclear factor I-C（nuclear factor I-C，Nfic），and apply dual luciferase reporter gene system to determine the association between microRNA-20a（miR-20a）and its potential target gene Nfic.MethodsThe potential complementary binding sites of miR-20a and Nfic were predicted by Targetscan.The 3′UTR of Nfic fragment amplified by PCR was cloned into luciferase reporter vector MIR-Report Luciferase.The luciferase reporters containing 3′UTR of Nfic and miR-20 mimics（experimental group）or NC mimics（control group）were co-transfected into 293-AD cells.Cells were collected，and then dual-luciferase reporter assay was performed to detect the luciferase activity of the two groups of cells，consequently the relationship between miR-20a and Nfic was identified.The miR-20a mimics and NC mimics were transfected into marrow stromal cell line ST2 respectively.The total cell lysates were collected，and the expression level of NFIC was detected by Western blotting assay.ResultsResults of double enzyme digestion and DNA sequencing showed that sequence of luciferase reporter vector was correct.miR-20a specificity bounded to Nfic 3′UTR and inhibited the luciferase activity of the reporter construct（P＜0.05）.Western blotting assay showed that the NFIC protein level was obviously down-regulated in ST2 cells after the transfection of miR-20a mimics compared with that of control.ConclusionThe luciferase reporter vector containing the 3′UTR of Nfic is constructed successfully，which confirms that miR-20a can direct effect on Nfic3′UTR and repress its luciferase activity.

microRNAs；3′untranslated regions；miR-20a；nuclear factor I-C；marrow stromal cell line；luciferase reporter gene

R349.6

A

10.11958/20160318

國家自然科學基金資助項目（81271977，81472040）

1天津醫科大學代謝病醫院內分泌研究所、衛生部激素與發育重點實驗室（郵編300070）；2天津醫科大學基礎醫學院

王珊（1991），女，碩士在讀，主要從事分子生物學與病原生物學研究

E-mail:bliwang72@163.com