高效固氮花生根瘤菌株的篩選

劉瑞瑞　危期　劉夢函

摘要：以采自河北省保定市淶水縣的花生根瘤為原材料，進行花生根瘤的采集、菌株分離純化和回接試驗，通過研究接種不同根瘤菌菌株對天府3號花生生長的影響，成功篩選出可與該種花生高效固氮的優良菌株。研究結果表明：接種Hbu074005菌株效果最佳，花生植株干質量較對照組提高52.29%，其結瘤數、果穗數、植株株高等指標也明顯優于對照組及其他處理，分別較對照提高235.56%、112.00%、31.31%；菌株Hbu074012、Hbu074004的表現僅次于Hbu074005，干質量分別較對照提高43.13%、35.88%。由結果可以看出，菌株Hbu074005可顯著提高天府3號花生的生產性狀，是較為優良的花生高效共生固氮菌株。研究結果為高效固氮根瘤菌在花生農業生產中的應用奠定理論基礎，具有一定的現實生產意義。

關鍵詞：花生；根瘤菌；高效固氮；盆栽試驗

中圖分類號： S182；S154.39 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0472-04

花生（Arachis hypogaea）別稱落花生、番豆、地豆、長生果，屬豆科落花生屬，為1年生草本植物，是中國主要的油糧兩用作物。2012年，中國花生播種面積為470萬hm2，產量居油料作物首位，占世界花生產量的40.8%[1]?；ㄉ缓鞍踪|、脂肪等多種營養成分，且供給相對均衡，是目前較為理想的種植作物，具有良好的經濟價值和藥用價值[2]。花生果仁通常用作食用油提取的原材料，花生油脂在紡織、印染工業上可用作乳化劑、潤滑劑，為工業生產提供便利[3]。相關研究證實，花生根莖中含有豐富的白藜蘆醇[4-5]。白藜蘆醇是一種良好的植物抗菌素，具有抗氧化、抗腫瘤、保護心血管的作用，被喻為繼紫杉醇之后又一新的綠色抗癌藥物[6-7]。目前，白藜蘆醇的產量遠不能滿足醫藥市場的需求，開發花生根莖白藜蘆醇生產產業具有重大的醫藥用價值和深遠的社會意義。我國花生多種植在遼東半島、山東半島、東南沿海地區以及黃河、長江流域的部分地區。與其他常規作物相比，花生具有強抗逆、耐瘠薄、適應性強、生產效益高的特點。在能源短缺和環境危機日益嚴峻的社會背景下，花生殼、花生枝條等自然狀態下的生物質可以通過生物轉換和熱化學交換制備焦油、焦炭、液態燃料等，即可用作能源，又可作為化工原料。相關研究報道，1 t花生油下腳料可以轉化為近1 t的生物柴油，這種利用花生油下腳料轉化的生物柴油與傳統柴油相比不含對人體有害的硫和苯，燃燒后污染物排放量減少50%，是一種綠色、清潔、可再生的能源[8]。因此，花生作為一種生物質新能源必將得到更快更好的發展[9]。近年來，許多國家在擴大豆科植物的生產面積，但在實際生產中過分依賴化學合成肥料，使得土壤中氮磷單一養分過高，造成土壤板結，土壤養分失調[10]。并且化肥施用會導致土壤和水污染等一系列環境問題的產生。在化肥零增加的政策下，如何提高作物產量并保良土壤是我們面臨的一個重要課題。

根瘤菌與豆科植物共生是生物固氮作用最強的體系，所固定的氮約占生物固氮總量的65%[11-12]。然而豆科植物與根瘤菌共生具有較強的專一性，新種植的土壤中有效根瘤菌的數量往往很少，固氮效率低，必須接種高效固氮根瘤菌才會顯示固氮生長優勢[13]，因此，人工接種優良菌株可以充分發揮固氮作用，提高作物產量[14-15]。豆科植物與根瘤菌共生固氮優良組合篩選一直是生物固氮研究領域中的熱點[16-18]。有關花生根瘤菌的研究表明，不同自然環境中的花生根瘤菌遺傳多樣性差異明顯[19-20]，花生根瘤菌菌種的多樣性，為花生的增產提供了理想豐度的菌種資源庫。我國目前對于豆科植物根瘤菌應用的研究很多[21-23]，對花生根瘤菌的研究也已卓見成效。周平貞等對我國各省接種花生根瘤菌的增產作用進行了分析總結，其平均增產率可達13.4%，其中接種凍干菌劑與草炭菌劑分別可增產38.0%、45.4%[24]。近年來，吳海燕等已經篩選出了適合吉林省、四川省花生品種的優良菌株[25-26]。目前，河北省優良花生根瘤菌選育的研究報道較少，劉杰等分析表明，河北地區花生根瘤菌具有更大的多樣性[27]。本研究以采自河北省保定市淶水縣花生根瘤為試驗材料，通過分離純化得到根瘤菌純培養物，進行回接試驗，篩選并保存生產性狀優良的根瘤菌菌株，為實現花生增產、減少土壤污染、培肥地力、改善生態環境奠定了理論基礎，并具有一定的生產價值和社會意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及分離

以河北省保定市淶水縣婁村滿族鄉為采集地點，進行天府3號花生根瘤的采集。

選取飽滿根瘤若干，無菌水沖洗干凈后用95%乙醇浸泡處理5 min，5% NaClO浸泡處理1 min，然后用無菌水沖洗 5～6次，以充分洗去殘留的消毒液；將消毒后的根瘤置于無菌培養皿中，用無菌竹簽壓破根瘤，使根瘤內容物流出，用接種環蘸取根瘤汁液在YMA固體平板上劃線，置于28 ℃恒溫箱中培養5～7 d，直至長出單菌落。從平板上挑選圓形、光滑有光澤、邊緣整齊、稍有突起的具有典型根瘤菌菌落形態特征的單菌落，革蘭氏染色鏡檢。選取革蘭氏染色陰性、細胞形態桿狀的培養物進行純化。純化后接種于YMA斜面，4 ℃存放備用，并轉接于含20%甘油的YMA液體培養基中，-80 ℃保存。

1.2 高效菌株的土壤篩選

1.2.1 土壤 采用滄州黃驊鹽堿土，并添加10%沙作為土壤基質。將土壤壓碎去雜，按照鹽堿土 ∶ 沙=9 ∶ 1的比例充分混勻，稱取1.0 kg置于種植花盆中，種植前適量澆水，保持土壤濕潤。

1.2.2 種子催芽 選用天府3號花生品種，取光滑飽滿、粒大的花生種子。將種子依次用95%乙醇浸泡處理5 min，5% NaClO浸泡處理1 min，然后用無菌水沖洗5～7次進行消毒。將消毒后的種子均勻置于墊有濕潤濾紙的150 mm直徑培養皿中，26～30 ℃黑暗避光生長。

1.2.3 接種與培養 待芽長至1 cm左右，挑選長勢好的發芽花生，每5個1組放入滅菌培養皿中，加入2 mL菌液，侵染30 min后植入花盆進行土壤篩選試驗，用塑料薄膜封閉盆口（待幼苗長出時將薄膜劃開）。每個處理設5個重復，以不接菌為空白對照。將接種后的花生轉入28 ℃、光照時間12 h的溫室，隨機排列放置，根據花盆失水狀況定期澆水。

1.2.4 作物生長指標的采集 培養至40 d可觀察到植物開花，培養至85 d時開始觀測結果，觀測項目包括植株株高、結瘤數、果穗數及地上部分干質量（以第1張葉葉痕處為劃分標準，植物樣品先在烘箱中于105 ℃殺青2 h，然后于65 ℃烘干至恒質量）。篩選出性能優良的菌株繼續回接2～3次，得到重復性好的穩定菌株。

1.3 培養基及試劑

YMA固體培養基：KH2PO4 0.25 g，K2HPO4 0.25 g，NaCl 0.1 g，甘露醇10 g，酵母粉0.8 g，瓊脂14 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，蒸餾水1 L，pH值6.5～7.0。試劑：革蘭氏染液、無菌水、95%乙醇、5% NaClO。

1.4 數據處理與統計分析

數據通過SPSS 13.0進行單因素方差分析，在滿足方差分析的情況下，利用Tukey檢驗進行多重比較，確定各因子水平內部不同水平平均值之間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 根瘤菌的分離與培養

通過對根瘤樣品的分離、純化，共得到花生根瘤菌菌株19株，從表1可以看出，接種根瘤菌菌株對花生植株株高、干質量、結瘤數、果穗數均有顯著影響，這可能是花生接種根瘤菌后，與其匹配的菌株提高了花生的氮素營養水平，從而為花生后期的生長發育和產量提高打下基礎。

2.2 根瘤菌對花生生長及產量的影響

花生接種根瘤菌85 d后收獲，測定植株株高、干質量、結瘤數、果穗數等。通過對接種不同根瘤菌菌株的作物進行單因素方差分析，通過均值分析，獲得花生植株干質量、結瘤數、株高等生長性狀（表2）。

從表2可以看出，接種不同的根瘤菌均能增加花生植株株高及干質量，說明施用根瘤菌肥能明顯促進花生的營養生長[28]，增加其生物量及干物質積累量。不同的菌株對花生的促進作用存在差別，說明根瘤菌與植物之間共生固氮存在一定的匹配性。所有供試菌株中，對干質量影響較大的菌株依次順序為Hbu074005、Hbu074012、Hbu074004，分別比對照高52.29%、43.13%、35.88%，且這3株菌株均與對照組差異顯著。接種不同根瘤菌對花生植株株高也表現出促進作用，與對照相比，試驗組花生株高均有不同程度的增加。影響較大的菌株依次為Hbu074017、Hbu074005、Hbu074014，分別較對照提高31.65%、31.31%、29.59%，其中菌株Hbu074005、Hbu074017與其他多數菌株差異顯著。對結瘤數影響較大的 接種根瘤菌的處理組果穗數均較對照有不同程度的增加。且接種不同的花生根瘤菌對花生產量性狀的影響不同，相互間差異較大。接種表現較好的處理為Hbu074004，果穗平均為12.0個，較對照組提高140.0%；接種菌株Hbu074005、Hbu074012的花生果穗數分別較對照組提高112.0%、84.0%。表明接種根瘤菌可以明顯提高豆科作物花生的產量和品質。

對接種表現較好的處理進行植株干質量方差分析，結果見圖1。綜合各項指標分析，所有處理中以菌株Hbu074005總體效果最好，其次為菌株Hbu074012、Hbu074004。菌株Hbu074017的結瘤數、株高增加顯著，但其干質量卻僅比對照增加16.79%，原因有待分析。

2.3 接種根瘤菌Hbu074005對花生生長狀況的影響

花生接種根瘤菌Hbu074005后，植株莖稈粗壯，分蘗數多，生長旺盛，產量性狀也有明顯的提高（圖2）。對照組中，花生植株莖稈稍細，長勢較弱，果穗數也低于試驗組。

3 討論與結論

花生是我國主要的油、糧兩用作物，在我國廣泛種植?；ㄉ嵌箍浦参铮箍浦参锏拇竺娣e栽培需要人工接種根瘤菌。陳文新提到，在一個地區，如果從未種植過或5年以上沒有種過某種豆科植物，土壤中很難有與該種豆科植物相匹配的土著根瘤菌[13]。因此在少施氮肥的條件下，如果沒有有效的共生根瘤菌進行結瘤固氮給植物提供營養，植物很難在該地實現高產，因此對高效固氮根瘤菌株的篩選具有重要意義。

本研究篩選了3株優良的根瘤菌菌株Hbu074005、Hbu074012、Hbu074004，其干質量及其他生長指標都較為理想。具有最大結瘤數的菌株Hbu074005同時具有最大干質量，在其他處理中干質量與結瘤數呈正相關。說明接種合適的根瘤菌能夠顯著提高花生的結瘤能力，增加植株的生物量和含氮量，對花生生長發育具有明顯的促進作用和增產效應，林國林等研究也證明了這一點[29]。劉曉云等研究表明，來源相同的菌株接種后測試指標差異很大，表明土著菌經過篩選后是可以得到高效菌株的[30]；鐘文文等也已利用分子標記技術從土著菌中成功篩選出與盛世苜蓿相匹配的高效苜蓿根瘤菌菌株[31]。

研究中發現，接種菌株Hbu074004后，植株干質量及株高較對照明顯增加，但結瘤數提升并不顯著，說明僅依靠結瘤數指標不能準確判斷菌株固氮能力的高低，結瘤是一個耗能的過程，結瘤數過多會給植物增加一定的負擔。此外，接種菌株Hbu074017后花生地上部分生長旺盛，株高、分蘗數較對照有顯著差異，根部結瘤數比較顯著，但植物的干質量貢獻較其他指標低，果穗數也較少并且發育不成熟。因此篩選高效菌株，結瘤數可作為一個參考指標。

綜合考慮各項指標，菌株Hbu074005對天府3號花生具有較高的固氮效率，可明顯促進其生長發育，可作為進行天府3號花生種植時匹配的根瘤菌菌株。

本研究選用鹽堿土作為土壤基質。河北地區鹽堿耕地較多，其中絕大多數屬于中、低產田，若能被充分利用，將是非常寶貴的土壤資源。在鹽堿地區種植豆科作物，可通過豆科植物與根瘤菌共生作用，使植物獲得生長所需的大部分氮素，同時可以增加土壤中微生物的豐富度，明顯改善土壤的營養狀況。本研究應用鹽堿土篩選所獲得的高效菌株，可用于鹽堿地的花生種植栽培，具有較好的現實意義。

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