小蓬竹根際土壤可培養細菌多樣性

李鵬　劉濟明　文愛華

摘要：以羅甸縣小蓬竹根際土壤為研究對象，采用稀釋平板法調查土壤微生物數量，并挑選菌落形態存在差異的細菌菌株，對其16S rDNA序列進行分析，構建系統發育樹，研究根際土壤可培養細菌多樣性，為小蓬竹的保護以及喀斯特山地土壤微生物多樣性研究提供一定的理論依據和技術支撐。結果表明：小蓬竹根際土壤微生物數量由多到少為細菌>放線菌>真菌，干土中所含細菌、真菌、放線菌的平均數量分別為8.32×107、9.19×105、2.32×106 CFU/g。分離純化共獲得菌落表型差異的細菌41株，16S rDNA有效序列進行Blast比對，可劃分為26個分類單元，Shannon-Wiener多樣性指數H為1.067 9，豐富度指數S為7，均勻度指數J為0.548 8，優勢度指數D為0.521 7?；诩毦?6S rDNA序列建立系統發育樹，結果表明：30株細菌屬于厚壁菌門（Firmicutes）（按單元種類數計算所占比例為73.17%），10株屬于變形菌門（Proteobacteria）（24.39%），1株屬于擬桿菌門（Bacteroidetes）（2.44%），其中芽孢桿菌屬（Bacillus）占絕對優勢。由結果可知，小蓬竹根際土壤中含有較為豐富的微生物多樣性。

關鍵詞：小蓬竹；根際土壤；可培養細菌；微生物多樣性

中圖分類號： S154.3 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0223-04

根際微生物是指存在于植物根系微區域直接影響土壤的結構、生物化學活性及土壤養分利用效率[1]的微生物類群，主要包括細菌、放線菌、真菌、藻類和原生動物等。根際土壤微生物具有數量龐大、種群結構復雜、代謝旺盛、繁殖速度快等特點，推動土壤物質與能量的流動，將土壤微生物種群、數量以及分布作為評價土壤生態環境質量的重要指標。根際微生物的研究越來越受到學者的重視[2-3]，國內有關茶樹[4]（Camellia sinensis）、烤煙[5]（Nicotiana tabacum）、檳榔[6]（Semen arecae）、野生稻[7]（Oryza rufipogon）根際微生物的研究較多。但是對喀斯特地區土壤微生物種群多樣性的研究相對較少，針對于小蓬竹根際土壤微生物種群多樣性的研究更是一片空白。

小蓬竹[Drepanostachyum luodianense （Yi et R. S. Wang） Keng f.]對于喀斯特環境具有很好的生境適應性以及較強的抗逆性，在裸露的喀斯特石山甚至懸崖上均有廣泛分布[8]。叢生的小蓬竹的枝葉可較好地覆蓋裸露的巖層，提高喀斯特地區植被的覆蓋率，其地下部分可以減少水土流失、改良土壤理化性質，進而提高土壤活力。在石漠化治理中關于石漠化地區植被恢復物種的選擇上，小蓬竹完全可以作為一個很好的候選物種。因此，開展小蓬竹根際微生物研究，掌握小蓬竹根際土可培養微生物數量及種群結構，對于小蓬竹的保護、豐富喀斯特地區土壤和竹類微生物資源，都具有很好的理論及現實意義。

本研究采用稀釋平板法統計小蓬竹土壤微生物數量，分離純化其根際土壤中的細菌，并基于16S rDNA序列特征對分離的菌株進行系統發育分析，初步獲得小蓬竹根際細菌的物種多樣性信息，以期為進一步開展小蓬竹對惡劣的喀斯特生境適應性與微生物關系研究和喀斯特地區微生物資源的開發利用提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 土樣的采集與處理

于2014年5月上旬，選擇小蓬竹主產區羅甸，該區域為典型的喀斯特丘陵地貌，小蓬竹群落分布較為典型。試驗地位于坡下位，地理位置為106°45′17″E、25°30′39″N，平均海拔757 m，土壤為典型的喀斯特石灰土，土壤肥力較高，pH值為7.68。沿等高線分別設置5個樣地（5 m×5 m），在各樣方隨機選10株竹，沿著竹基部挖取健康根系，采集土壤的深度為 5～20 cm，連同根系一起裝入無菌袋中并注明采集地點、日期、土樣號（輕輕抖動1 min，取附著根系2 mm左右的土壤為根際土）[9]。試驗所用小蓬竹根際土壤為5個樣地采集的等量混合土壤樣品，土樣冰箱低溫保存（4 ℃），以進行微生物的分離和計數（1周內分離）。

1.2 根際微生物的分離計數

（1）細菌分離和培養采用牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15～25 g，加水補足至1 000 mL，pH值7.4～7.6。（2）真菌分離培養采用馬丁氏-孟加拉紅培養基：KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨 5 g，葡萄糖10 g，1/3 000孟加拉紅（Rose Bengal）100 mL，瓊脂15～20 g，加水補足至1 000 mL，pH值自然。培養基也可以加入青霉素，加入量為100 U/mL，同時加入慶大霉素 160 U/mL，主要是為了抑制細菌的生長，減少干擾性。（3）放線菌培養采用改良高氏1號培養基：可溶性淀粉20 g，KNO3 1 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂20 g，pH值7.4～7.6 （每300 mL培養基中加3%重鉻酸鉀1 mL）。

牛肉膏蛋白胨培養基、孟加拉紅培養基、PDA培養基和改良的高氏1號培養基于121 ℃滅菌20 min，土壤微生物的分離計數每種培養基倒6皿，純化時每種培養基倒3皿，凝固成平板備用。

采用稀釋平板涂抹法，在無菌培養皿中倒入15～20 mL選擇性培養基，待凝固后，用無菌移液槍吸取0.1 mL各稀釋度的土壤懸液，不同濃度稀釋度的土壤懸液在牛肉膏蛋白胨培養基、高氏1號培養基和孟加拉紅瓊脂培養基平板上進行涂布培養。細菌于37 ℃培養2～4 d，放線菌于28 ℃培養 7 d，真菌于28 ℃培養5 d，然后進行分離、計數（細菌和放線菌的最佳計數的菌落形成單位在30～300個之間，真菌的菌落形成單位在10～100個之間）。

1.3 細菌16S rDNA的擴增

采取購買的生工生物工程（上海）股份有限公司Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取分離純化的細菌基因組DNA，提取之后的DNA選用細菌通用引物（正向引物27 F；反向引物1495 R）對細菌、放線菌的16S rDNA擴增，然后采用1.2%瓊脂糖凝膠（含0.5 mg/L溴化乙錠）電泳檢測。

選用細菌通用引物[10]（正向：27 F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向：1 495 R，5′-CTACGGCTACCTTGTTALGA-3′），采用適宜的反應條件，對16S rDNA進行PCR擴增。正向引物27F、反向引物1 495R分別位于大腸埃希氏菌（Escherichia coli）16S rDNA序列的8～27位和1 495～1 514 位的堿基位置上。

細菌采用50 μL的PCR反應體系：Taq PCR Master Mix 25 μL；基因組DNA模板1 μL；正向引物27F 2 μL；反向引物1495R 2 μL；Nuclease-free ddH2O 20 μL。擴增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 3 min，51 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，30個循環；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。用1.2%瓊脂糖凝膠（含0.5 mg/L溴化乙錠）電泳進行檢測。

1.4 16S rDNA序列分析

PCR擴增產物送英濰捷基（上海）貿易有限公司 （Invitrogen） 測序，測序后登陸GenBank對比，利用GenBank通過BLAST對測序結果進行比對分析，下載最相近菌株的16S rDNA序列，用Clustal X[11]按照最大同源性的原則進行排序，采用Kimura 2（Kimura，1980）計算核苷酸差異值[12]，再采用Neighbor-Joining[13]構建系統進化樹，自展數（bootstrap）為 1 000。

1.5 細菌種群的多樣性分析

定義16S rDNA、ITS rDNA序列同源性>97%作為同一分類單元[14]，采用Shannom-Wiener指數（H）、均勻度（Pielou）指數（J）、豐富度指數（S）和Simpson優勢度指數（D），分析小蓬竹根際土壤環境的微生物多樣性特征。

多樣性Shannom-Wiener指數：

H=-∑Si=1PilnPi。

式中：Pi為第i種的多度比例，可表示為Pi=Ni/N，Ni為屬i的單菌落數量，N為根際土樣的所有菌株數之和。

Pielou指數：

J=-∑Si=1PilnPi/lnS。

式中：S為分類單元，可表示為屬（種）i所在根際土壤中屬（種）的數目。

根際土壤中不同物種所起的作用及所占的地位，選用Simpson優勢度指數表示，公式如下：

D=∑P2i。

2 結果與分析

2.1 小蓬竹根際土壤微生物數量分析

由表1可知，干土中微生物數量由多到少為細菌>放線菌>真菌，細菌在根際土壤中占絕對優勢，占根際土壤微生物總數的96.25%。小蓬竹根際土壤中，干土中約含有細菌832×107 CFU/g，與張友杰等對烤煙不同生育期根際土壤微生物含量變化的研究（3.73×107個/g干土）結果[15]在同一數量級；約含放線菌2.32×106 CFU/g，比雍太文等對不同種植模式下小麥土壤根際微生物數量研究結果（2.3×105～3.8×105個/g 干土）結果[16]高1個數量級；約含真菌9.19×105 CFU/g，與殷瑤等對不同年齡麻瘋樹林土壤放線菌、真菌（14.68×104～22.46×104 CFU/g）的研究結果[17]在同一數量級。

2.2 小蓬竹根際土壤細菌種群多樣性分析

利用牛肉膏蛋白胨培養基對小蓬竹根際土壤的41株細菌分離培養物的16S rDNA進行測定，共獲得41條有效序列。登陸GenBank，進行相似性對比表明，它們分屬于7屬26種。小蓬竹根際土壤細菌Shannon-Wiener多樣性指數H為1067 9，豐富度指數S為7，均勻度指數J為0.548 8，及優勢度指數D為0.521 7。土壤細菌菌株與數據庫中已知細菌的16S rDNA具有較高的相似度，從97%到99%不等（表2）。

細菌16S rDNA序列的系統發育樹結果（圖1）顯示，所得41條有效序列主要分屬3大類群。其中30株細菌屬于厚壁菌門（Firmicutes）（按單元種類數計算所占比例為73.17%），10株屬于變形菌門（Proteobacteria）（24.39%），1株屬于擬桿菌門（Bacteroidetes）（2.44%）。

厚壁菌門在小蓬竹根際細菌種類中所占比例較高，成為根際可培養細菌的最優勢類群。該類群29株細菌（68.4%）均與芽孢桿菌屬（Bacillus）關系密切，細菌16S rDNA序列除B-107與Bacillus sp. CL1.8（AM934693.1）的相似度為97%外，其余均為99%，相似度極高；僅1株與動物球菌屬（Planococcus）關系密切，16S rDNA序列相似度為98%。

變形菌門為分離得到的第二大優勢類群，其中5株與溶桿菌屬（Lysobacter spp.）關系密切，細菌16S rDNA序列相似度為99%；2株與假單胞菌屬（Pseudomonas）關系密切，16S rDNA序列相似度為99%；2株與貪銅菌屬（Cupriavidus）密切相關，16S rDNA序列相似度為99%；反1株與鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）關系密切，16S rDNA序列相似度為98%。

1株擬桿菌門（Bacteroidetes）的細菌（B-12）與金黃桿菌屬（Chryseobacterium）關系密切，16S rDNA序列相似度為99%。

3 討論

3.1 小蓬竹根際土壤微生物數量

小蓬竹根際土壤干土中所含微生物總數為8.64×107 CFU/g，總體上小蓬竹根際土壤中微生物總數較多，細菌數量占優勢，防線菌次之、真菌數量較少。花棒微生物總數及細菌、真菌、放線菌數量均高于小蓬竹根際土壤微生物數量[18]?；夷旧徣斯ち值赝寥牢⑸锎骸⑶?、冬季2種林地都是細菌>放線菌>真菌[19]。華菊玲等對連作芝麻根際土壤微生物群落的研究表明，新生、連作2、5年芝麻地微生物數量與本研究的微生物細菌、真菌、放線菌數量都在同一數量級[20]。

3.2 小蓬竹根際土壤細菌多樣性

小蓬竹根際土壤細菌主要分為三大類，分別為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門。李潞濱等研究發現，毛竹、冷箭竹共有細菌類群厚壁菌門、變形菌門[21]，其中在毛竹的厚壁菌門方面，本研究結果與之較為相似。小蓬竹細菌類群的芽孢桿菌屬占絕對優勢，與竹林根際可培養微生物種群多樣性分析結果[22]一致。雖然小蓬竹與冷箭竹（Bashania fangiana）[23]、毛竹（phyllostahys pubescens）[21]根際土壤微生物種類之間存在一定的相似性，但具有其自身特有的菌群結構。

本研究僅采用牛肉膏蛋白胨單一培養基分別對小蓬竹根際土壤細菌進行分離研究，初步揭示了小蓬竹根際土壤特有生境中微生物種群的組成特征，但仍然存在一定的局限性。應采用多種有效的培養基對土壤樣品進行更為全面的分離培養，將充分了解小蓬竹根際可培養微生物細菌種群的完整信息。此外，由于自然環境中大部分微生物不能通過常規方法進行培養，應用傳統的微生物分離培養方法研究土壤微生物區系將導致微生物多樣性嚴重丟失[24]。對于小蓬竹根際土壤未培養或不能培養的微生物，非常有必要采用不依賴純培養的分子生物學方法，以獲取更全面的小蓬竹根際微生物多樣性信息。

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