耐抽薹大白菜—結球甘藍單體異附加系后代的獲得

趙玉靖　滑帆　趙建軍

摘要：利用60Co-γ輻射結合自交及游離小孢子培養，培育耐抽薹大白菜-結球甘藍單體異附加系的后代群體。結果表明，隨著輻射劑量的增加，自交結角率變化無顯著規律，而結籽率則呈下降趨勢；隨著輻射劑量的增加，游離小孢子培養的胚狀體誘導率和植株再生率顯著下降，輻射劑量高于60 Gy時，胚狀體誘導率為0。

關鍵詞：大白菜；結球甘藍；單體異附加系；耐抽薹；輻射誘變；游離小孢子；培養

中圖分類號： S634.032 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0196-02

大白菜（Brassica rapa L.ssp.pekinensis）是我國種植面積最大的蔬菜作物之一[1]。先期抽薹給大白菜的春季栽培帶來很大困擾，影響了大白菜的周年均衡供應，而最好的解決方式是培育耐抽薹的品種[2]。結球甘藍與大白菜同科同屬，較大白菜具有耐寒、耐熱性強、耐抽薹、富含硫代葡萄糖苷（簡稱硫苷，glucosinolate）等優良特性。筆者所在課題組已獲得了耐抽薹大白菜-結球甘藍單體異附加系，但單體異附加系遺傳不穩定，且攜有的非目的基因較多。

近年來，輻射誘變以其能提高植物基因水平上的突變頻率，有利于打破性狀連鎖和促進基因重組[3]，而被廣泛應用于新品種選育和種質資源創新工作中，成為常規育種的重要補充手段之一。輻射誘變最常用的是60Co-γ射線[4]。60Co-γ射線能顯著影響組織或細胞的生長發育及生理生化過程，一定劑量的射線能造成染色體的斷裂，傷害程度與輻射劑量呈顯著正相關[5]。輻射劑量的選擇是影響誘變效果的關鍵因素，過大或過小均可造成輻射無效或致死率太高[6]。輻射誘變在麥類[5]、棉花[7]等作物上研究較多，但在大白菜遺傳育種上鮮有報道。本研究以耐抽薹大白菜-結球甘藍單體異附加系為材料，利用60Co-γ輻射結合自交及游離小孢子培養途徑，創制該單體異附加系的后代群體，為獲得遺傳穩定的易位系提供必要的材料與方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為耐抽薹大白菜-結球甘藍單體異附加系AC4。由河北農業大學蔬菜分子染色體工程與新品種選育團隊提供。AC4為組培苗，誘導生根后于2012年1月移栽到溫室營養缽中，冬季自然低溫春化，3月22日定植到大棚，常規管理。

1.2 試驗方法

1.2.1 輻射誘變后自交 雌配子未經輻射處理而雄配子經輻射處理后自交：取AC4的健壯花枝，水培于三角瓶中，進行60Co-γ射線輻射處理。輻射劑量率1 Gy/min，設0（對照）、30、45、60、75 Gy 5個劑量梯度。輻射后去除該花枝上已開花朵，套袋隔離，用以提供花粉。選取未輻射處理的AC4植株上適宜授粉的花蕾，去除雄蕊，分別授以經0、30、45、60、75 Gy輻射的新鮮花粉，套袋隔離，成熟后收獲種子M1。

雌雄配子輻射處理后自交：取AC4初花期整棵植株進行60Co-γ射線輻射處理，輻射劑量率1 Gy/min，輻射劑量分別為30、45 Gy。對輻射劑量為30 Gy的植株上適宜授粉的花蕾去雄，授以經30 Gy輻射的花粉，套袋隔離；對輻射劑量為45 Gy的植株上適宜授粉的花蕾去雄，分別授以經30、45、60、75 Gy輻射的新鮮花粉，套袋隔離，成熟后收獲種子M1。

1.2.2 輻射誘變后游離小孢子培養 晴朗的上午，溫度 18～20 ℃，取AC4主枝、一級側枝上適宜花蕾進行游離小孢子培養。以未經輻射誘變花蕾小孢子培養為對照，待輻射處理24 h后，分別取輻射劑量為30、45、60、75 Gy花枝上適宜的花蕾，進行游離小孢子培養。培養方法及胚狀體植株再生方法參照申書興等的方法[13-14]。

2 結果與分析

2.1 AC4輻射誘變后的結角率和結籽率

隨著輻射劑量的增加，結角率沒有明顯的變化規律，而結籽率明顯變化（表1）。對于父本接受輻射、母本未輻射的雜交組合，除授粉組合Ⅱ（父本輻射劑量為30 Gy，母本未輻射）的結籽率為46%，稍高于授粉組合Ⅰ（父母本均未接受輻射）的結籽率外，其他組合的結籽率均呈現隨輻射劑量的增加而下降的趨勢；父本母本均接受輻射的組合，除組合Ⅷ（父、母本輻射劑量均為45 Gy）外，母本輻射劑量相同時，結籽率隨父本接受劑量的增加而下降。父本輻射劑量相同時，母本接受的輻射劑量越大，結籽率也越低。即父、母本接受的輻射劑量均影響結籽率。以上輻照處理，共計獲得耐抽薹大白菜-結球甘藍單體異附加系AC4自交種子2 962粒。

2.2 AC4花蕾輻射誘變后游離小孢子培養的胚狀體誘導率及植株再生率

AC4不經輻射的適宜新鮮花蕾進行游離小孢子培養（圖1-A），其胚狀體誘導率為7.2個/蕾、植株再生率為48.8%（表2），共208個胚狀體發育成植株。輻射誘變后的游離小孢子培養，隨著輻射劑量的增加，胚狀體誘導率和植株再生率顯著下降。輻射劑量為30 Gy時（圖1-B），胚狀體誘導率、植株再生率分別為2.71個/蕾和36.4%，16個胚狀體發育成植株；輻射劑量達到45 Gy時（圖1-C），胚狀體誘導率、植株再生率分別降低至0.11個/蕾和27.7%，2個胚狀體發育成植株；輻射劑量增至60 Gy時，胚狀體誘導率降低至0。結果表明，花蕾輻射劑量顯著影響游離小孢子培養的胚狀體誘導率和植株再生率。

輻射劑量為30、45 Gy 的花蕾進行游離小孢子培養，33 ℃ 高溫預處理24 h后，25 ℃暗培養7～11 d形成肉眼可見的球形胚，18～21 d形成成熟的子葉形胚（圖1），轉入MS培養基（圖2-A），2～3 d后胚狀體轉綠（圖2-B）。在胚狀體植株再生（圖2-C）過程中，存在胚狀體褐化死亡的現象（圖2-D）。

3 討論

任正隆等采用常規雜交選育方法，以單體異附加系為試材，獲得了小麥-黑麥小片段染色體易位系[8]。李瑞芬等以單體異附加系花藥培養誘導染色體易位[9]。本研究以耐抽薹大白菜-結球甘藍單體異附加系為材料，利用60Co-γ輻射結合自交及游離小孢子培養途徑，獲得了3 188個該單體異附加系的后代，為進一步篩選易位系提供了必要材料。輻射可使染色體斷裂，從而實現外源染色體片段向受體親本基因組的轉移[10]，以提高易位系的合成頻率。同時以游離小孢子培養替代花藥培養，排除了培養過程中花藥壁等體細胞的干擾[11]和易出現嵌合體的現象。

本研究中隨著輻射劑量的增加，結籽率呈下降趨勢，游離小孢子培養的胚狀體誘導率和植株再生率呈顯著下降趨勢，表明60Co-γ射線輻射降低了花粉、游離小孢子的活力，且降低程度與輻射劑量呈正相關。在棉花上也報道了60Co-γ射線破壞花粉活力，降低結籽率[12]。成熟的雌雄配子體對 60Co-γ具有較強的耐受性；而游離小孢子的活力下降與輻射劑量呈顯著正相關，推測是在雄配子形成早期的小孢子階段對輻射誘變的耐受性較差引起的。在本研究中自交結籽率下降幅度小，這可能是由于白菜中含有豐富的抗輻射物質硫代葡萄糖苷[13]。

李桂英等在研究輻射花粉對小麥×黑麥雜種結實率的影響時發現，低劑量射線輻射黑麥花粉時，結實率比對照略有提高[14]，表現出低劑量輻射的刺激效應。本試驗中輻射劑量為30 Gy的花粉做父本時，授粉的結籽率稍高于對照，也表現出了低劑量的刺激效應。

參考文獻：

[1]張淑江，李 菲，章時蕃，等. “十一五”我國大白菜遺傳育種研究進展[J]. 中國蔬菜.2011（6）：1-8.

[2]余陽俊，張鳳蘭，趙岫云，等. 大白菜晚抽薹性快速評價方法[J]. 中國蔬菜，2004（6）：16-18.

[3]劉麗強，劉軍麗，張 杰，等. 60Co-γ輻射對觀賞海棠組培苗的誘變效應[J]. 中國農業科學，2010，43（20）：4255-4264.

[4]陳秋芳，王 敏，何美美，等. 果樹輻射誘變育種研究進展[J]. 中國農學通報，2007，23（1）：240-243.

[5]李明杰，張建偉，臺國琴，等. 60Co-γ-射線對黑麥的誘變效應研究[J]. 河南農業大學學報，2010，44（4）：370-374.

[6]葉力勤，楊世宏. γ射線輻射誘變中應注意的幾個問題[J]. 寧夏農林科技，2002（5）：49-50.

[7]胡保民，張天真. 陸地棉單體的誘發及鑒定[J]. 棉花學報，1996，8（1）：14-17.

[8]Ren Z L，Zhang H Q. Induction of small-segment-translocation between wheat and rye chromosomes[J]. Science in China（Series C Sciences），1997，40（3）：323-331.

[9]李瑞芬，趙茂林，張敬原，等. 單體異附加系花藥培養創制小麥-中間偃麥草純合易位系[J]. 西北植物學報，2006，26（1）：28-32.

[10]Hasterok R，Wolny E，Kulak S，et al. Molecular cytogenetic analysis of Brassica rapa-Brassica oleracea var. alboglabra monosomic addition lines[J]. Theoretical and Applied Genetics，2005，111（2）：196-205.

[11]徐艷輝，張 凱. 大白菜游離小孢子培養研究的回顧與展望[J]. 遼寧農業科學，2000（6）：30-34.

[12]Yue J Y，Tang C M. Effects on agronomic traits of M1 by pollen of upland cotton irradiated by 60Co-γ ray[J]. Agricultural Science&Technology，2012，13（3）：525-528.

[13]廖永翠，宋 明，王 輝，等. 大白菜中硫代葡萄糖苷的鑒定及含量分析[J]. 園藝學報，2011，38（5）：963-969.

[14]李桂英，王琳清，施巾幗. 輻照花粉對小麥×黑麥雜交結實率及雜種胚胎發育的影響[J]. 麥類作物學報，2005，25（6）：15-19.