不同逆境對葡萄酒相關酵母生長特性的影響

王鳳梅 馬利兵

摘要：為了探究葡萄酒相關酵母對不同逆境的耐受性，從內蒙古西部釀酒葡萄產區分離到4株葡萄酒酵母，分別為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）及克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）。采用杜氏小管發酵法測試這4株酵母對不同逆境（低pH、高酒精度、高濃度SO2、高濃度葡萄糖及高濃度鹽）的耐受性。結果表明，葡萄汁有孢漢遜酵母耐低pH能力、耐高SO2能力與耐高鹽能力最弱；釀酒酵母耐酒精能力強，耐高糖能力最弱；東方伊薩酵母耐高鹽能力弱，耐SO2能力最強；克魯維畢赤酵母耐酒精能力與耐高鹽能力最強。

關鍵詞：葡萄酒；酵母；發酵條件；耐受性；逆境

中圖分類號：TS261.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）05-1264-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.05.044

Effects of Different Stresses on the Growth Characteristics of Wine-related Yeasts

WANG Feng-mei1，MA Li-bing2

（1. Baotou Light Industry Vocational Technical College，Baotou 014030， Inner Mongolia，China；2. School of Mathematics， Physics and Biological Engineering， Inner Mongolia University of Science & Technology，Baotou 014010， Inner Mongolia，China）

Abstract：In order to test the resistance of wine-related yeasts on different types of stresses， four strains of wine-related yeasts（Hanseniaspora uvarum，Saccharomyces cerevisiae，Issatchenkia orientalis and Pichia kluyveri），isolated from wine grape producing area in the western district of Inner Mongolia， were used as materials. Durham tube fermentation were used to test their resistance on different types of stresses （low pH value，high alcohol concentration， high SO2 concentration， high glucose concentration and high salt concentration）. The results showed that Hanseniaspora uvarum had the lowest resistance on low pH value， high SO2 concentration and high salt concentration. Saccharomyces cerevisiae had high resistance on high alcohol concentration， however， had the lowest resistance on high glucose concentration. Issatchenkia orientalis had low resistance on high salt concentration， however， had the highest resistance on high SO2 concentration. Pichia kluyveri had the highest resistance on both high alcohol concentration and high salt concentration.

Key words： wine； yeast； fermentation conditions； resistence； stress

目前，中國葡萄酒生產菌種大部分依賴進口，單一釀酒酵母菌種的純種發酵使得葡萄酒失去了其特有的香氣和風味。如果用天然釀酒酵母接種發酵或者與其他非釀酒酵母菌種混合進行發酵，就可以生產出具有地區特色的葡萄酒[1，2]。非釀酒酵母在葡萄酒生產中不能完全發酵，產酒精的能力也稍差，但在葡萄酒的酒體結構、香氣及地區特色等方面卻能起到積極作用[3]。因此，充分利用各類酵母的特點和優勢，有效控制敗壞性酵母的負面影響，會使葡萄酒具有更加復雜的口感和香氣，也可以改善單一菌種帶來的不良影響[4，5]。本研究對內蒙古西部地區分離到的4株葡萄酒相關酵母的低pH耐受性、酒精耐受性、SO2耐受性，高糖耐受性、高鹽耐受性進行研究，旨在為混合接種不同酵母的葡萄酒發酵工藝控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 培養基

YPD培養基：酵母浸粉1%（m/V，g/mL），蛋白胨2%（m/V），葡萄糖2%（m/V，g/mL）[6]。

1.2 試驗菌株

內蒙古西部釀酒葡萄產區通過分離鑒定得到的葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）及克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）[7]。

1.3 菌種活化、擴大培養及接種

將保藏的釀酒酵母菌株分別接種于YPD液體培養基中，于28 ℃下培養48 h。隨后，將活化后的菌種按5%的接種量接種于已裝有100 mL YPD液體培養基的三角瓶中，28 ℃、72 r/min搖床中培養72 h。利用血球計數板對擴大培養的菌種進行計數（表1）。

1.4 菌種耐受性測試

1.4.1 低pH耐受性測試 將5 mL滅菌后的YPD液體培養基加入帶有杜氏發酵管的試管中，將pH分別調整到2.0、3.0、4.0、5.0和6.0，按表1所示的接種量分別接種酵母，3次重復，25 ℃下培養3 d，根據產氣量確定酵母菌生長情況。

1.4.2 酒精耐受性測試 將5 mL滅菌后的YPD液體培養基加入帶有杜氏發酵管的試管中，加入95%的乙醇，將乙醇體積分數分別調整為10%、12%、14%和16%，按表1所示的接種量分別接種酵母，3次重復，25 ℃下培養4 d，根據產氣量確定酵母菌生長情況。

1.4.3 SO2耐受性測試 分別將5 mL滅菌后的YPD液體培養基加入帶有杜氏發酵管的試管中，加入6%Na2SO3，將SO2濃度分別調整為100、150、200及250 mg/L，按表1所示的接種量分別接種酵母，3次重復，25 ℃下培養3 d，根據產氣量確定酵母菌生長情況。

1.4.4 高糖耐受性測試 將5 mL滅菌后的YPD液體培養基加入帶有杜氏發酵管的試管中，加入葡萄糖，使其濃度分別為30%、40%、50%和60%（m/m），按表1所示的接種量分別接種酵母，3次重復，25 ℃下培養3 d，根據產氣量確定酵母菌生長情況。

1.4.5 高鹽耐受性測試 將5 mL滅菌后的YPD液體培養基加入帶有杜氏發酵管的試管中，加入NaCl，使其濃度分別為8%、10%、12%、14%和16%（m/m），按表1所示的接種量分別接種酵母，3次重復，25 ℃下培養3 d，根據產氣量確定酵母菌生長情況。

2 結果與分析

2.1 酵母菌株對低pH的耐受性

酵母菌在酸性條件下，發酵能力最強，最適pH為4.5～5.5。在pH很低的條件下，酵母菌生長受到抑制，并生成揮發酸[8]。由圖1可知，在pH為4.0～6.0時，所有供試菌株均能旺盛生長；而在pH為3.0時，其生長受到抑制，葡萄汁有孢漢遜酵母最低只能耐受pH為4.0的環境，pH為3.0時不能生長，耐受能力最弱。

2.2 酵母菌株對酒精的耐受性

過高的酒精濃度對酵母有毒性，會抑制細胞的生長及發酵活性。所以，酵母的發酵能力在很大程度上取決于其自身對酒精耐受力的大小[9]。由圖2可知，隨著酒精度的增高，酵母菌的生長繁殖受到抑制，酒精度越高，酵母菌的生長繁殖越弱。在酒精度為10%～14%時，各菌株均能生長，16%時，葡萄汁有孢漢遜酵母和東方伊薩酵母受到抑制不能生長，釀酒酵母和克魯維畢赤酵母雖受到抑制，但均能生長。

2.3 酵母菌株對高SO2的耐受性

在葡萄酒生產過程中，葡萄質量好的情況下，SO2使用量在30～100 mg/L；在葡萄質量相對較差的情況下，使用量不超過80～150 mg/L[3]。在葡萄酒標準中，SO2的含量不能超過250 mg/L[10]。因此，葡萄酒釀造用酵母菌株要求有較高的耐SO2能力。由圖3可知，所有供試菌株均能耐受200 mg/L的SO2。東方伊薩酵母的耐SO2能力最強，能耐受250 mg/L的SO2。

2.4 酵母菌株對高糖的耐受性

糖的濃度影響酵母的生長和發酵。含糖量在12%～18%的葡萄汁發酵最為迅速，隨著糖濃度的升高，發酵能力逐漸受到抑制。由圖4可知，所有供試菌株均可耐受50%的葡萄糖，但當葡萄糖濃度達到60%時，釀酒酵母不能生長。糖含量的變化對克魯維畢赤酵母的生長狀態沒有影響。

2.5 酵母菌株對高鹽的耐受性

不同類型微生物對滲透壓變化的適應能力不同，大多數微生物在1%～3%的NaCl濃度范圍內可正常生長，10%～15%的NaCl濃度能抑制大部分微生物的生長[11]。由圖5可知，NaCl濃度在8%～10%時，所有供試菌株生長狀態良好，克魯維畢赤酵母能耐受16%的鹽含量，耐受能力最強。鹽含量對釀酒酵母的生長狀態沒有影響。

3 小結與討論

在葡萄酒發酵過程中，如果能夠充分利用非釀酒酵母的優點及其與釀酒酵母間有益的相互作用，能釀造出風味復雜、風格獨特的葡萄酒。據報道[12]，葡萄汁有孢漢遜酵母可以通過代謝和自溶來提高葡萄酒的香氣，并且有非常好的產酯能力，參與復雜新鮮的風味物質的形成。葡萄汁有孢漢遜酵母、克魯維畢赤酵母有葡萄糖苷酶活性，其中葡萄汁有孢漢遜酵母比釀酒酵母具有更強的產酶能力，尤其在發酵早期，這些非釀酒酵母對葡萄漿中的酶反應有積極的貢獻。東方伊薩酵母有較好的降解蘋果酸的能力，對改善葡萄酒的風味也有積極的作用。

在葡萄酒生產中，葡萄酒相關酵母的生長繁殖受到很多因素的影響，如酒精度、SO2添加量、營養物狀況及葡萄園的地理位置和氣候等。只有控制和利用好這些條件，酵母在葡萄酒中生產中的積極作用才能充分展現。葡萄酒在發酵過程中，酵母不可避免地會受到各種脅迫條件的影響。而當脅迫條件超過細胞的極限生理功能時，便會對細胞的生存和發酵過程產生負面影響[13，14]。因此，為了避免發酵過程發生阻遏或遲滯現象，要求酵母必須具備足夠的脅迫應答能力來抵御脅迫條件所造成的影響[15，16]。酵母抵御不良環境的能力與發酵過程能否順利進行和生產效率的高低密切相關。

本研究對分離到的葡萄酒相關酵母的耐受性進行了測試，結果表明，在所測試的4個酵母菌種中，葡萄汁有孢漢遜酵母耐低pH能力、耐SO2能力與耐高鹽能力最弱；釀酒酵母耐酒精能力強，耐高糖能力最弱；東方伊薩酵母耐高鹽能力弱，耐SO2能力最強；克魯維畢赤酵母耐酒精能力與耐高鹽能力最強。葡萄酒相關酵母的耐受性研究可為葡萄酒混合接種酵母的發酵工藝研究提供依據。

參考文獻：

[1] QUEROL A， RAMON D. The application of molecular techniques in wine microbiology[J]. Trends in Food Sci Technol， 1996，7（3）：73-78.

[2] HEARD G. Novel yeasts in winemaking looking to the future[J]. Food Australia， 1999，51（8）： 347-352.

[3] 李 華.葡萄酒工藝學[M].西安：陜西人民出版社，1995.

[4] BLANCO P，V？魣ZQUEZ-AL？魪N M，LOSADA A.Influence of yeast population on characteristics of the wine obtained in spontaneous and inoculated fermentations of must from Vitis vinifera Lado[J].J Ind Microbiol Biotechnol，2008，35（3）：183-188.

[5] BLANCO P， MIR？魣S-AVALOS J M， ORRIOLS I. Effect of must characteristics on the diversity of Saccharomyces strains and their prevalence in spontaneous fermentations[J]. J Appl Microbiol，2012，112（5）：936-944.

[6] BARNETT J A， PAYNE R W， YARROW D. 酵母菌的特征及鑒定手冊[M].山東青島：青島海洋大學出版社，1984.

[7] 王鳳梅，馬利兵，劉樹文.內蒙古土默川平原葡萄酒相關酵母多樣性研究[J].食品生物技術學報，2009，28（3）：385-389.

[8] 陳思妘，肖熙佩.酵母生物化學[M].濟南：山東科學技術出版社，1990.

[9] 吳 帥，肖冬光，原通磊，等.高耐性釀酒酵母菌種的篩選[J].釀酒科技，2006（9）：37-40.

[10] 馬佩選.葡萄酒質量與檢驗[M].北京：中國計量出版社. 2002.

[11] 沈 萍，陳向東.微生物學實驗[M].北京：高等教育出版社， 2007.

[12] VILLENA M A， IRANZO J F U， P REZ A I B. β-Glucosidase activity in wine yeasts： Application in enology[J]. Enzyme and Microbial Technology， 2007， 40（3）： 420-425.

[13] CARRASCO P， QUEROL A， DEL OLMO M. Analysis of the stress resistance of commercial wine yeast strains[J]. Archives of Microbiology， 2001， 175（6）： 450-457.

[14] OROZCO H， MATALLANA E， ARANDA A. Oxidative stress tolerance， adenylate cyclase， and autophagy are key players in the chronological life span of Saccharomyces cerevisiae during winemaking[J]. Appl Environ Microbiol，2012，78（8）： 2748-2757.

[15] IVORRA C，P？魪REZ-ORT？魱N JE，DEL OLMO M.An inverse correlation between stress resistance and stuck fermentations in wine yeasts. A molecular study[J].Biotechnol Bioeng，1999， 64（6）：698-708.

[16] KASAVI C，ERASLAN S，ARGA K Y，at al. A system based network approach to ethanol tolerance in Saccharomyces cerevisiae[J].BMC Syst Biol，2014，8（1）：90.