多菌復合固態發酵富硒豆粕的工藝優化

邱豐艷 陳柳花 林標聲 楊小燕

摘要：研究了移動袋裝多菌復合固態發酵富硒豆粕的最佳生產工藝條件。選用地衣芽孢桿菌、釀酒酵母、產朊假絲酵母、嗜酸乳桿菌4種菌株，通過移動袋裝固態發酵技術復合發酵富硒豆粕，利用響應面分析法對其發酵條件進行優化，并對產品進行品質檢驗。結果表明，豆粕富硒發酵的最優菌株配比為地衣芽孢桿菌∶釀酒酵母∶產朊假絲酵母∶嗜酸乳桿菌=2∶1∶2∶2；亞硒酸鈉、豆粕、菌液接種量為影響發酵過程中重要的3個因素，其最佳配比為亞硒酸鈉19.43 mg/kg、豆粕91.38%、菌液接種量11.62%，經驗證試驗，在該條件下有機硒轉化率能達到55.48%；富硒豆粕發酵產品經檢驗，其直觀評價、有機硒含量、營養成分、有害物質等指標均得到明顯改善，符合國家《飼料添加劑安全使用規范》。豆粕經多菌株聯合富硒發酵，其產品性能得到明顯改善，是一種優質的富硒菌制劑和功能性蛋白飼料。

關鍵詞：固態發酵；復合菌；富硒；豆粕；響應面分析法

中圖分類號：S816.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）05-1247-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.05.040

Optimization of the Solid-state Fermentation of Soybean Pulp Enriching

Selenium by Compound Bacteria

QIU Feng-yan1，CHEN Liu-hua1，LIN Biao-sheng1，2，YANG Xiao-yan1，2

（1.College of Life Science，Longyan University，Longyan 364012，Fujian，China；

2.Key Laboratory of Fujian Universities Preventive Veterinary Medicine and Biotechnology， Longyan 364012， Fujian，China）

Abstract： The optimum process conditions of soybean pulp enriching selenium solid-state fermentation by compound bacteria in the mobile bag were studied， the four strains Bacillus licheniformi， Saccharomyces cerevisiae， Candida utilis， Lactobacillus acidophilus were used in soybean meals enriching selenium fermentation by moving solid-state fermentation technology， and the response surface method was used to optimize the fermentation conditions， then the product quality was inspected. The results revealed that the optimal conditions of soybean pulp enriching selenium fermentation were as flows： the ratio of Bacillus licheniformi， Saccharomyces cerevisiae， Candida utilis to Lactobacillus acidophilus was 2∶1∶2∶2. Sodium selenite， soybean pulp and inoculum size were the three main factors in fermentation， its proportioning were 19.43 mg/kg，91.38%，11.62%， respectively. On the optimized conditions， the convert ratio of organic selenium transformation can achieve to 55.48%. The product quality of soybean meals enriching selenium fermentation was inspected， its visual evaluation， the content of organic selenium， nutrition， and other harmful substances indicators had improved significantly， comply with the national standard “Specification for the safe use of feed additives”. Overall， through compound bacteria enriching selenium fermentation， the product performance of soybean pulp had improved significantly， it was good bacteria preparation and functional protein feed.

Key words： solid-state fermentation； compound bacteria； selenium-enriched； soybean pulp； response surface method

硒是動物體必需的微量元素之一[1]，在動物體內有多種功能，其基本作用是作為谷胱甘肽過氧化物酶的組成成分，參與消除已生成的過氧化物而起到保護細胞膜的作用[2]。硒攝入不足會引起仔豬的白肌病和桑葚心、豬的營養性肝病、產生PSE肉等動物缺硒疾病[3]。但如果直接在動物飼料中添加無機硒，安全性較差[4]。近年來，人們通過動物、植物、微生物作為轉化載體來獲取有機硒，取得了較大的進展[5]，如啤酒酵母液體富硒發酵等[6]，但液體發酵有機硒，成本高，廢液排放量大，對環境污染大[7]。豆粕是動物飼料蛋白資源的首選，畜牧業需求旺盛，微生物發酵豆粕能夠較好地利用豆粕的營養價值，降低抗營養因子，提高豆粕利用率，成為豆粕飼料應用的發展趨勢[8]，但傳統的堆積發酵豆粕，存在著發酵溫度、水分不易控制，雜菌污染嚴重的問題。為此，本研究將有機硒轉化和豆粕發酵結合起來，采用呼吸膜裝置進行移動袋裝固態發酵，將有機硒轉化和發酵豆粕生產結合，已經轉化的有機硒直接保留于豆粕原料中，豆粕大分子蛋白降解為可以被動物直接消化吸收的小分子蛋白，使得產品成為一種優質的、含微量元素硒的功能性蛋白飼料[9]。移動固體發酵富硒豆粕有效地解決了液體發酵有機硒的難題，且發酵過程中發酵占地少，溫度、水分控制精確，雜菌污染少，生產效率大大提高，具有良好的實際應用前景[10]。本試驗選用地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、產朊假絲酵母（Candida utilis）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）4種菌株，通過移動袋裝固態發酵技術復合發酵富硒豆粕，利用響應面分析法對其發酵條件進行優化，并對產品進行品質檢驗。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌種：地衣芽孢桿菌、釀酒酵母、產朊假絲酵母和嗜酸乳桿菌，均為凍干菌粉，龍巖學院微生物實驗室保存，各有效菌經液體活化后活菌數均為1 010 個/mL。

豆粕：市場購買，蛋白含量40.26%（采用凱氏定氮法測定）。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程 多菌復合固態發酵富硒豆粕工藝流程如下：

發酵菌種→37 ℃紅糖水活化

↓

發酵原料→混合→呼吸膜包裝、密封→發酵（溫度、時間）→檢測產品（營養成分、有機硒含量）。

1.2.2 微生物菌株配比對豆粕富硒發酵的影響 采用地衣芽孢桿菌、釀酒酵母、產朊假絲酵母、嗜酸乳桿菌4種菌株，每種菌株活菌數取值1.0×1010 個/mL或2.0×1010個/mL，按L8（27）正交試驗表安排8組代表各菌株用量的比例組合，將設定的各菌比例、總菌量按10%接種量加入37 ℃溫水攪拌，活化20 min，溫水中含總發酵物料10%紅糖。菌株活化后，與89%豆粕、1%硫酸銨混合均勻，按15 mg/kg比例添加亞硒酸鈉，并補充水分至總發酵物料的30%，用裝量20 kg呼吸膜包裝、密封，30 ℃發酵7 d，發酵后檢測分析、對比產物各項指標，選定最適的菌株組合比例用于下一步響應面分析試驗。各指標的檢測方法參照國家飼料檢測分析標準[11]，檢測指標包括總菌數、粗蛋白、多肽、乳酸含量和有機硒轉化率。菌體總數采用平板菌落計數法、粗蛋白采用凱氏定氮法、多肽含量測定采用三氯乙酸可溶性氮（TCA-NSI）法、乳酸含量測定采用試劑盒乳酸脫氫酶法，硒含量的測定采用3，3-二氨基聯苯胺比色法[12]，有機硒的轉化率=（總硒含量-無機硒含量）/總硒含量×100%[7]。

1.2.3 豆粕富硒發酵效果關鍵因素篩選的Plackett-Burman試驗設計 在含呼吸膜的20 kg裝量發酵袋中按設定的比例接入發酵原料（亞硒酸鈉、豆粕、硫酸銨）、紅糖水活化后的發酵混合菌株，并按比例補足水分，包裝、密封，在設定的溫度下進行發酵5～10 d，定時取樣測定，檢驗發酵效果。采用響應面分析法中Plackett-Burman 試驗設計，以白玉菇菌糠發酵后亞硒酸鈉有機硒轉化率為響應值篩選影響發酵效果的顯著因素，Plackett-Burman試驗設計因素和水平見表1。

1.2.4 豆粕富硒發酵效果的Box-Behnken響應面優化設計試驗 在Plackett-Burman試驗設計的基礎上，選擇對響應值影響顯著的關鍵因素進行Box-Behnken響應面優化試驗，確定影響豆粕富硒發酵效果的最佳工藝條件，并進行最佳工藝條件下的驗證試驗。

1.2.5 富硒發酵豆粕產品的品質檢驗 將未發酵前培養基的組成和最佳工藝條件下生產的富硒發酵豆粕產品進行品質檢驗，包括直觀評價、pH、有機硒、粗蛋白、粗灰分、乳酸、總有益菌、胰蛋白酶抑制劑含量等，對比發酵前后各項指標的變化，分析豆粕富硒發酵后產品性能的變化情況。pH采用梅特勒FE.20 pH計測定；粗灰分采用坩堝灼燒法測定；總氨基酸含量采用S433D全自動氨基酸分析儀測定；粗纖維采用酸堿消煮法測定；粗脂肪采用索氏抽提法測定；脲酶采用酚紅試劑法測定；生物素采用高效液相色譜法測定，以上各檢測指標的檢測方法同樣參照國家飼料檢測分析標準[11]，其他檢測指標測定方法同上。胰蛋白酶抑制因子的測定參照GB/T 21498-2008[13]、植物血球凝集素測定采用凝集效價法[14]。

2 結果與分析

2.1 豆粕富硒發酵各微生物菌株配比的確定

各菌株質量濃度比按L8（27）的正交試驗表設定，加入原料按工藝流程進行發酵，結束后檢測分析產物各項指標，結果如表2所示。結果表明，各菌株試驗組合中，當地衣芽孢桿菌菌體量比例高時，總菌數、多肽含量較高，培養基中剩余的粗蛋白含量較低，原因可能是地衣芽孢桿菌生長速度較快且其產蛋白酶能力較強[15]，所以能在發酵培養基中大量生長，分泌胞外蛋白酶降解豆粕粗蛋白獲得大量的多肽，培養基中豆粕剩余的粗蛋白含量就較少；但當釀酒酵母、產朊假絲酵母、嗜酸乳桿菌含量較高時，對地衣芽孢桿菌的生長造成一定影響，因而總菌數降低、多肽含量降低、粗蛋白含量較高；嗜酸乳桿菌的生長有受到地衣芽孢桿菌的影響，當嗜酸乳桿菌含量較高時，培養基中的乳酸含量較高，而乳酸含量較高則有利于提高產品風味、刺激采食，但乳酸太高、酸味太重也會影響采食；各菌株對有機硒的轉化率也有所不同，釀酒酵母、產朊假絲酵母菌體含量較高時，有機硒轉化率較高。此外，由于具有富集硒和胞內大量積累谷胱甘肽（GSH）的功能，產朊假絲酵母近年來廣泛應用于富硒酵母的制備，其不僅可以補充硒還可以提高機體的免疫力[16]。因此，綜上所述，選定地衣芽孢桿菌∶釀酒酵母∶產朊假絲酵母∶嗜酸乳桿菌=2∶1∶2∶2的比例組合，此條件下各菌株能較好地協同生長、代謝，發酵產物的各項指標能達到較好的平衡。

2.2 豆粕富硒發酵效果關鍵因素的篩選結果

利用Minitab 15軟件對表1的Plackett-Burman試驗設計進行擬合和方差分析，結果見表3、表4。結果表明，影響豆粕富硒發酵效果的因素重要性排序是亞硒酸鈉（X1）>豆粕（X3）>菌液接種量（X5）>發酵物料含水量（X6）>發酵溫度（X7）>發酵時間（X8）>硫酸銨（X4）>紅糖（X2）。其中，亞硒酸鈉（X1）、豆粕（X3）、菌液接種量（X5）對響應值的影響達到了顯著水平，因此，選定這3個水平進行正交試驗分析。

2.3 Box-Behnken響應面優化設計試驗結果

以有機硒轉化率為響應值進行Box-Benhnken設計，三因素三水平的響應面設計及試驗結果見表5。利用Design-Expert 7.0 軟件對試驗數據進行回歸分析，得到響應值有機硒轉化率和各因素變量之間的二元回歸方程為Y=+55.74+1.75×A+1.09×B+0.21×C+0.62×A×B-0.28×A×C+0.61×B×C-1.68×A2-1.56×B2-1.54×C2，對回歸模型進行方程分析，結果見表6所示。結果表明，該模型具有統計學意義（P< 0.000 1），失擬項不顯著（P=0.070 8>0.05），表明回歸方程擬合情況好，誤差小，能較好地描述各因素與響應值之間的關系，可以利用該方程確定影響豆粕富硒發酵效果的最佳工藝條件。從各因素方差分析結果可以看出，對響應值有機硒轉化率影響的大小順序為亞硒酸鈉（A）、豆粕（B）、菌液接種量（C），其中亞硒酸鈉（A）和豆粕（B）對響應值結果影響顯著。

各因素響應面曲面分析結果如圖1所示，根據所得的模型可預測得到最佳豆粕富硒發酵工藝條件為亞硒酸鈉19.43 mg/kg、豆粕91.38%、菌液接種量11.62%，在該條件下有機硒轉化率能達到56.30%。分別按上述的最優工藝條件進行3次平行試驗，所得有機硒轉化率平均為55.48%，比Plackett-Burman試驗設計時的響應值50.58% 提高4.9個百分比，與理論預測值56.30%接近，重復性較好，說明響應面優化所得的參數準確、可靠、可行，且能進一步優化試驗條件，取得更優的試驗結果。

2.4 富硒發酵豆粕產品的品質檢驗

富硒發酵豆粕發酵前后產品的品質檢驗結果如表7所示，結果表明豆粕富硒發酵后各項檢測指標均得到了明顯改善，其培養基中的無機硒轉化成了有機硒，發酵后產生了大量的乳酸，pH下降，有較為明顯的乳酸味、酒香味；發酵后富硒豆粕的粗蛋白、多肽、粗脂肪、總氨基酸、生物素等營養成分均明顯高于發酵前，而畜禽不易利用的粗纖維成分含量降低，但干物質由于發酵過程中的損失而下降，粗灰分含量有所升高；發酵后豆粕中的脲酶、胰蛋白酶抑制劑、植物血球凝集素3種抗營養因子含量明顯降低，符合國家《飼料添加劑安全使用規范》（中華人民共和國農業部公告第1224號，2009年）。

3 小結與討論

本試驗通過多菌聯合發酵制備富硒發酵豆粕，發酵后其粗蛋白、多肽的含量有所增加，有利于滿足動物體內蛋白需求，表明菌體發酵過程中能利用非蛋白氮轉化為菌體蛋白，且菌體產生的各種胞外酶能有效地分解大分子蛋白為多肽，大大提高了豆粕蛋白的利用效率[17]。酵母菌近年來被廣泛運用于豆粕的富硒發酵，其對有機硒的轉化率較高，易生長、富集作用強[18]，特別是產朊假絲酵母還具有胞內大量積累谷胱甘肽的功能，不僅可以補充硒還可以提高機體的免疫力，是無機硒轉化為有機硒的理想載體，本試驗中無機硒的轉化率達到了50%以上，效果顯著，能有效地滿足動物機體對硒的需求。枯草芽孢桿菌產酶量較高，其與酵母菌、乳酸菌混合發酵，有利于發酵豆粕中的多肽含量的增加，且枯草芽孢桿菌還能大量分泌纖維素酶，其添加有利于底物纖維素含量的降低[19]。此外，微生物發酵過程中，消耗了部分有機物，發酵后產品的干物質量有所減少，且由于發酵過程添加了多菌株等成分，發酵后產品灰分含量有所增加[20]。研究表明，經多菌株聯合發酵，豆粕中脲酶、胰蛋白酶抑制劑、植物血球凝集素抗營養因子能夠得到明顯的消除，大大提高了豆粕的利用效率[21，22]，與本研究結果一致。添加的嗜酸乳桿菌使得發酵富硒豆粕產品的直觀評價有了較為明顯的改善，產品比發酵前出現了明顯的乳酸味、酒香味，有利于刺激動物采食，提高飼料的利用率，降低料肉比，促進生長[23]。

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