36種中草藥提取物對煙草赤星病菌的抑制作用

袁圓 桑維鈞 石春發(fā) 刁朝強(qiáng) 王德鳳 劉寧國 崔慶彩

摘要： 對36種中草藥分別進(jìn)行微波法提取及水蒸氣蒸餾法提取，以煙草赤星病菌（Alternaria alternate）

為供試菌種，采用菌絲生長速率法對其提取物進(jìn)行抑菌作用研究。結(jié)果表明，兩種方法的提取物對煙草赤星病菌基本都有抑制作用。其中，在微波法中，黃連和雄黃的提取物初步抑制作用最好，抑制率分別為91.15%和76.72%，桑寄生、甘草和白果在60%以上。在室內(nèi)毒力測定研究中，黃連和雄黃的EC50分別為7.077 3 mg/mL和140.651 3 mg/mL。在水蒸氣蒸餾法中，抑菌作用最強(qiáng)的是大黃、七葉一枝花和肉桂，抑制率均在60%以上，分別為69.93%、68.14%和63.07%。

關(guān)鍵詞： 中草藥； 提取物； 煙草赤星病菌（Alternaria alternate）

中圖分類號：S432.4+4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）05-1159-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.05.018

The Inhibitory Effects Thirty-six Herbal Medicine Extracts against Alternaria alternate

YUAN Yuan1a，SANG Wei-jun1b，SHI Chun-fa1a，DIAO Zhao-qiang2，WANG De-feng1a，LIU Ning-guo1a，CUI Qing-cai1a

（1a.College of Agriculture；b.College of Tobacco，Guizhou University，Guiyang 550025，China；

2.Guiyang Prefecture Branch，Guizhou Tobacco Company，Guiyang 550001，China）

Abstract：36 kinds of herbs were respectively extracted with microwave and steam distillation， the inhibition of which was carried out by mycelial growth rate method with Alternaria alternate as the test object. The results showed that the extracts of the two methods had inhibitory effects on A.Alternate. The best preliminary inhibitory effects were rhizoma coptidis and realgar of the microwave method， their inhibition rate were 91.15% and 76.72% respectively， the mulberry parasitism， liquorice and gingko were above 60%. In the study of indoor toxicity measurement，EC50 of rhizoma coptidis and realgar were 7.077 3 mg/mL and 140.651 3 mg/mL. In the water vapour distillation， the strongest inhibitions were rhubarb， paris polyphylla and cinnamon， whose inhibition rate were over 60%，69.93%，68.14% and 63.07% respectively.

Key words： herbal extracts； Alternaria alternate； inhibitory effects

煙草赤星病的病原是鏈格孢菌[Alternaria alternate（Fries） Keissler]，該病主要發(fā)生在大田生長后期[1]，是危害中國煙草生產(chǎn)的一種重要真菌性病害[2，3]。貴州省主要煙區(qū)分布在興義、威寧、六盤水、畢節(jié)、大方、遵義等地。煙草赤星病的流行對煙葉產(chǎn)量及質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重影響，降低了煙葉商品的市場競爭力，常常給煙葉的生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前防治煙草赤星病的有效措施主要是化學(xué)防治，但是由于長時(shí)間使用化學(xué)合成農(nóng)藥，不僅破壞了生態(tài)環(huán)境，而且還增加了煙葉的農(nóng)藥殘留毒性。

中國中草藥資源豐富，目前已發(fā)現(xiàn)有殺菌活性的植物約有1 400余種，且發(fā)現(xiàn)在對人體致病菌有抑制作用的中草藥中，有些對植物病原菌也有很好抑制作用[4]。在小麥上，盧巴子、雞冠花和月季花等7種中草藥的乙醇提取物對小麥赤霉菌有明顯的抑制作用，其中雞冠花的抑菌率達(dá)100%[5]。丁香的丙酮提取液對小麥赤霉病菌和小麥紋枯病菌抑制率為100%，虎杖對小麥赤霉病菌和小麥紋枯病菌抑制率均在80%以上[6]。目前，已有很多關(guān)于中草藥抑菌方面的研究，但是在煙草赤星病上的報(bào)道較少。為此，本試驗(yàn)選取36種藥性各異的中草藥分別進(jìn)行微波法和水蒸氣蒸餾法提取，采用生長速率法對其提取物進(jìn)行室內(nèi)抑制作用測定，旨在篩選出有效防治煙草赤星病的中草藥，為生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 煙草赤星病菌于2014年6月在清鎮(zhèn)市煙草基地采集典型病株，在貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室分離純化保存。

1.1.2 供試中草藥 2014年7月購于貴陽市花果園鑫發(fā)藥業(yè)（表1）。

1.2 方法

1.2.1 提取物制備

1）微波法。中草藥于45 ℃條件下烘干，用粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，準(zhǔn)確稱取10 g溶于100 mL去離子水中，浸泡振蕩30 min，置微波中火（450 W）5 min，冷卻至室溫，重復(fù)一次，兩層濾紙抽濾，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中50 ℃減壓濃縮，在常溫下定容至10 mL，即濃度為1 g/mL。4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2）水蒸氣蒸餾法。中草藥于45 ℃條件下烘干，用粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，準(zhǔn)確稱取10 g溶于50 mL去離子水中，浸泡30 min，置于水蒸氣蒸餾裝置中反應(yīng)30 min，收集其蒸餾物，于4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 中草藥提取物的抑菌作用試驗(yàn) 采用生長速率法測定中草藥提取物對煙草赤星病菌菌絲生長的抑制作用[7]。將中草藥提取液與PDA培養(yǎng)基以1∶9的比例混勻后倒入培養(yǎng)皿，每個(gè)藥液3次重復(fù)，以去離子水為對照。用5 mm的打孔器沿著菌種同一個(gè)圓周打孔，用接種針小心將供試菌種接到含藥培養(yǎng)基上，菌絲面朝下，每皿一塊。于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)7 d。用十字交叉法測量菌落直徑，取平均值，計(jì)算抑制率。

相對抑制率=■×100%

（注：處理菌落直徑為減去原菌餅直徑5 mm后的值）

1.2.3 中草藥提取物室內(nèi)毒力測定 將抑制率在70%以上的中草藥提取液濃度合理劃分為3.125～50.000 mg/mL共5個(gè)梯度，每個(gè)濃度梯度3次重復(fù)，以去離子水為對照。按照“1.2.2”中的接種及培養(yǎng)方法，測量其直徑，計(jì)算抑制率。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理及分析 將生長抑制率轉(zhuǎn)換成抑制機(jī)率值，用藥劑濃度的對數(shù)和抑制機(jī)率值計(jì)算毒力回歸方程、抑制中濃度（EC50）及相關(guān)系數(shù)R，采用Excel和DPS處理相關(guān)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 中草藥提取物對煙草赤星病菌的抑制作用

中草藥微波法提取物對煙草赤星病菌的抑制作用結(jié)果見表2。由表2可知，36種中草藥提取液對煙草赤星病菌均有不同程度的抑制作用。抑制作用最好的是黃連和雄黃，抑制率分別為91.15%和76.72%；抑制率在60%以上的還有桑寄生、甘草和白果；還有6種提取液抑制率在50%以上。

中草藥水蒸氣蒸餾法提取物對煙草赤星病菌的抑制作用結(jié)果見表3。36種中草藥提取物對煙草赤星病菌均有不同程度的抑制作用。大黃、七葉一枝花和肉桂的抑制率分別為69.93%、68.14%和63.07%。其余除白豆蔻之外的抑制率均在50%以下。其中肉豆蔻的提取液對煙草赤星病病菌菌絲生長有促進(jìn)作用。

2.2 中草藥提取物對病菌的室內(nèi)毒力測定

根據(jù)中草藥提取物對煙草赤星病菌抑制效果分析，可知微波法提取的黃連和雄黃提取液對煙草赤星病菌的抑制率在70%以上。對這兩種提取物進(jìn)行了室內(nèi)毒力測定。結(jié)果如表4。由表4可知，在微波法中提取物濃度梯度在3.125～50.000 mg/mL時(shí)，黃連提取物的抑制率在30.71%～84.82%的范圍內(nèi)波動(dòng)。而雄黃在相同的濃度范圍內(nèi)，抑制率為17.68%～42.68%。二者提取物抑制率均伴隨著濃度的升高而增大。不同的是，雄黃的抑制率的增幅低于黃連，即當(dāng)雄黃提取物的濃度在50.000 mg/mL時(shí)其抑制率還達(dá)不到黃連提取物濃度為6.250 mg/mL時(shí)的抑制率。

由表5可知，黃連和雄黃提取物在本次毒力測定試驗(yàn)中的相關(guān)系數(shù)分別為0.975 910和0.945 992。毒力回歸方程分別為y=4.034 3+1.136 3x和y=3.652 3+0.627 4x。黃連的抑制中濃度EC50為7.077 3 mg/mL，遠(yuǎn)低于雄黃的140.651 3 mg/mL。

3 小結(jié)與討論

選用兩種提取方法對36種中草藥進(jìn)行處理，將其提取物對煙草赤星病菌進(jìn)行了室內(nèi)毒力測定。在微波法提取物濃度為1 g/mL時(shí)，篩選出了1種抑制率為91.15%、1種抑制率為76.72%和3種抑制率在60%以上的中草藥提取物。在水蒸氣蒸餾法中，篩選出抑菌作用在60%以上的中草藥提取物3種。

總體上看，本次試驗(yàn)中微波法提取物的抑菌率要高于水蒸氣蒸餾法。相比傳統(tǒng)的水蒸煮法，微波法操作方便、裝置簡單、反應(yīng)時(shí)間短、提取率高、試驗(yàn)安全。通過簡單的微波加熱，可以將中草藥的抑菌成分最大程度提取出來。水蒸氣蒸餾法適于提取中草藥中的揮發(fā)性物質(zhì)、小分子生物堿類及酚類等物質(zhì)，相對于微波法提取物范圍比較狹窄，因此可能在本次研究中抑制作用較弱。另外，由于是室內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果，以后還需要進(jìn)一步進(jìn)行活體試驗(yàn)研究。本次試驗(yàn)篩選的結(jié)果對于防治煙草赤星病提供了理論依據(jù)，為以后進(jìn)一步篩選中草藥活性物質(zhì)奠定了一些理論基礎(chǔ)。

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