軟棗獼猴桃內生真菌的分離純化及分子鑒定

廖林　郭睿昕　趙欣　李澤敏　毛子龍　楊玉紅

摘要： 以軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）枝條為試驗原料，采用內生真菌三步消毒法（乙醇-次氯酸鈉-升汞）對樣品進行表面消毒，從軟棗獼猴桃枝條組織分離出一株內生真菌菌株，命名為Y1，對Y1進行核糖體18S rDNA克隆測定，獲得長度為1 020 bp的18S rDNA序列，在NCBI數據庫上進行同源性比對，構建18S rDNA系統發育樹，并進行系統發育分析，鑒定該菌為子囊菌（Sac fungi）。

關鍵詞： 軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）； 內生真菌； 分離； 純化； 鑒定

中圖分類號：S432.4+4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）06-1459-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.06.024

軟棗獼猴桃（Actinidia arguta），又名軟棗子、獼猴梨、藤瓜，屬于獼猴桃科獼猴桃屬多年生落葉藤本植物。全世界獼猴桃屬植物共有66種，中國分布有62種。軟棗獼猴桃是9種光果獼猴桃種類之一[1-3]。軟棗獼猴桃的單果平均重18 g，最大果重33 g，果皮綠色光滑，果肉綠色、多汁、細膩、酸甜適度，含可溶性固形物15%左右，總糖8.8%，有機酸1.5%，維生素C 430 mg/100 g，是蘋果的100倍，氨基酸933.9 mg/100 g。而且，軟棗獼猴桃富含各種營養成分，具有各種醫療保健功效。軟棗獼猴桃汁具有阻斷致癌性亞硝基化合物合成的作用，還含有硫醇蛋白酶的水解酶和超氧化物歧化酶（SOD），可以嫩化肉類，具有養顏、提高免疫功能、增強抗癌、抗衰老、軟化血管、抗腫消炎的功能[4-9]。

植物內生菌是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物各種組織和器官內部或細胞間隙的真菌或細菌，被感染的宿主植物（至少是暫時）不表現出外在癥狀[6-9]，內生菌一般會產生一些在微生物-宿主關系中發揮作用的生物活性物質（如抗細菌、抗真菌、抗病毒物質等）。內生真菌研究的主要領域有內生真菌入侵宿主的分子機理、內生真菌與宿主的關系、內生真菌產生的生物活性物質的篩選等。內生真菌在醫藥、農業、工業領域越來越受到人們的關注[10-15]。

本試驗以軟棗獼猴桃為材料分離純化其內生真菌，篩選可產生活性成分的獼猴桃潰瘍病生防菌種，以便開發出農藥活性物質，為獼猴桃潰瘍病的防治和軟棗獼猴桃其他病害防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

軟棗獼猴桃枝條采自沈陽農業大學東北野生獼猴桃資源圃。試劑有75%乙醇、2%次氯酸鈉、0.1%升汞等。主要儀器有LDZX-40BI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（上海中安醫療器械廠）、SW-CJ-ICU雙人單面凈化工作臺（浙江蘇凈凈化設備有限公司）、HPX-9082 MBE數顯電熱培養箱（上海滬粵明科學儀器有限公司）、BX-53奧林巴斯顯微鏡（上海澤仕光電科技有限公司）、JD100-3電子天平（沈陽龍騰電子有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 PDA培養基的配制及滅菌 稱取300 g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加去離子水1 000 mL煮沸0.5 h，紗布過濾，再加10～20 g葡萄糖和17～20 g瓊脂，充分溶解后于0.1 MPa滅菌30 min，待溫度冷卻至40～50 ℃，在培養基中加入濃度為50 μg/mL的氨芐青霉素（防止細菌污染），充分混勻后將培養基倒入平皿中讓其自然冷卻凝固。

1.2.2 樣品組織表面消毒 將采集到的樣品組織在流水下沖洗掉表面塵土，室溫晾干后選取新鮮完整的獼猴桃組織作為材料。在無菌環境中依次用75%乙醇、2%次氯酸鈉、0.1%升汞分別消毒2 min。

1.2.3 內生真菌的分離純化[16-21] 將消毒好的樣品枝條用無菌刀切成約1 cm長的小段，每個平皿放4段，于28 ℃恒溫箱中培養，每天觀察內生菌的生長狀況。分離純化方法如圖1所示。

1.2.4 菌種的鑒定方法[22，23] 內生真菌的鑒定通常根據主要的群體和個體形態特點進行歸類與鑒定，同時可輔以生理生化及生態等特征加以鑒別。絲狀真菌的群體形態（即菌落形態）是鑒定的重要依據，如菌落大小、顏色、表面特征、質地和生長速度等，個體形態有菌絲、子實體、孢子和產孢結構等特征[24]。

純化后的菌株在生長的最佳時期，用接種針挑取位于尖端、底部及外緣等不同位置的菌絲，置于滴加去離子水的載玻片上，菌絲散開后蓋上蓋玻片，吸去多余的水分。在顯微鏡下觀察孢子及菌絲體的形態，并對其進行拍照。根據菌株的菌絲體和孢子的形態特征，對照真菌鑒定手冊進行初步鑒定[25]。顯微鏡觀察時也可以染色觀察，以方便觀察結果。

1.2.5 分子鑒定 形態學鑒定是傳統的方法，為確保鑒定的準確性，采用分子鑒定和形態鑒定相結合的方法。在rDNA中的18S基因具有高度保守性，可以用來進行在高分類水平上的系統發育關系的分析，以檢測和鑒定真菌。通過18S rDNA序列分析來鑒定軟棗獼猴桃內生真菌菌株，并反映菌株的系統發育關系。

2 結果與分析

2.1 軟棗獼猴桃內生真菌的菌種特征

按照最佳消毒條件，做多組重復試驗，對樣品枝條進行內生真菌的分離純化，最終篩選得到一株生長較好的內生真菌，并將其命名為Y1，以進行后續試驗。

內生真菌菌株在PDA培養基上培養，形成的菌落密度高、呈絨毛狀且菌絲體緊密。當菌株在PDA培養基上培養7 d后，形成菌落直徑可達2 cm，菌落表面呈乳白色，無光澤，中心突起（圖2左）。

分離純化后得到的單菌落Y1，在PDA培養基上培養，形成的菌落密度高、菌落表面呈白色，菌絲體松散。棉絮狀，菌絲體尖端有黑色孢子（圖2右）。

2.2 軟棗獼猴桃內生真菌的形態學鑒定

對軟棗獼猴桃內生真菌Y1進行制片，顯微鏡下觀察，菌株形態較簡單，菌絲生長發達，有隔，較細，光滑，竹結狀，且都是雙核菌絲（圖3）。根據觀察到的菌落形態和菌絲的結構特征，查閱真菌鑒定手冊及參考文獻進行初步鑒定。結果表明，所分離純化后得到的軟棗獼猴桃內生真菌屬于外囊菌屬真菌。為了得到更加準確的結果，對Y1內生菌進行分子鑒定。

2.3 分子鑒定

擴增Y1菌株18S rDNA序列，并進行電泳分析，如圖4所示。由圖4可知，Y1片段大小約1 000 bp，說明擴增的序列可以進行后續試驗。

將擴增的Y1 18S rDNA序列送至金唯智生物科技有限公司測序，測序后去除載體及引物序列，共1 020 bp，判斷正反方向，正向序列結果如下所示。

登陸NCBI網站Blast，下載同源性99%以上的序列，多重序列比對后，尋找最優核苷酸替代模型，并構建系統發育樹（圖5）。

Y1的18S rDNA序列在NCBI網站上Blast比對分析結果顯示，Y1與子囊菌（Sac fungi）相似度100%，結合形態鑒定，確定菌株Y1為子囊菌。

3 小結

從軟棗獼猴桃枝條中初步分離純化和鑒定獲得一株內生真菌，經過逐步純化后得到單一菌落，這株軟棗獼猴桃內生真菌命名為Y1。經形態學鑒定和分子鑒定，確定內生菌Y1為子囊菌。

參考文獻：

[1] 曹家樹，秦 嶺.園藝植物種質資源學[M].北京：中國農業出版社，2005.

[2] 劉慧濤，張冰冰，呂耀雙.東北地區野生獼猴桃資源現狀及開發利用[J].河北林果研究，1999，14（4）：326-330.

[3] 李坤明，胡忠榮，陳 偉.昭通地區野生獼猴桃資源及其利用評價[J].中國野生植物資源，2006，25（2）：39-41.

[4] 王曉東，段全猛.軟棗獼猴桃的利用與栽培[J].特種經濟動植物，2006，9（2）：33-34.

[5] 張菊明，林佩芳，何一中，等.中華獼猴桃多糖的免疫藥理學作用[J].中西醫結合雜志，1986，6（3）：171-174.

[6] 候芳玉.長白山產軟棗獼猴桃莖多糖抗感染和抗腫瘤作用的研究[J].白求恩醫科大學學報，1995，21（5）：472-475.

[7] 甘振威，張大旭，張婭婕，等.長白山區幾種野生漿果營養成分及延緩衰老作用[J].西安交通大學學報（醫學版），2004，25（4）：343-345.

[8] 馬月申，袁福貴，趙淑蘭.軟棗獼猴桃果實營養成分的測定[J].特產研究.1992（1）：44-45.

[9] 祝晨蔯，劉中秋，劉 良.革葉獼猴桃果實不同提取部位抗心肌缺血作用的比較研究[J].中藥藥理與臨床，2001，17（1）：19-21.

[10] 毛 帆.軟棗獼猴桃的栽培[J].特種經濟動植物，2007，10（10）：48-49.

[11] 饒衛華，敖禮林，熊振芳.軟棗獼猴桃的基本特性及商業栽培前景[J].中國南方果樹，2007，36（4）：63.

[12] 朱建華，田金河.獼猴桃生物活性物質研究進展[J].釀酒，2006， 33（3）：57-59.

[13] 樸一龍，趙蘭花.軟棗獼猴桃研究進展[J].北方園藝，2008（3）：76-78.

[14] ZINNIEL D K，LAMBRECHT P，HARRIS N B. Isolation and characterization of endophytic colonizing bacteria from agronomic crops and prairie plants[J]. Applied and Environmental Microbiologyaem，2002，68：2198-2208.

[15] SIEGEL M R，JOHNSON M C，VARNEYD R. A fungal endophytic in tall fescue： Ncidence and dissemination[J]. Phytopathology，1984，74：932-937.

[16] 伍時華，黃翠姬，石媛靖.酸乳菌種分離純化方法[J].食品科學，2004，25（10）：162-166.

[17] 熊素玉，姚新奎，譚小海.酸馬奶中乳酸菌的分離、純化與鑒定[J].新疆農業科學，2007，44（5）：696-701.

[18] 羅永蘭，張志元，冉國華.柑橘內生真菌的分離與鑒定[J].湖南農業大學學報（自然科學版），2005，31（4）：418-421.

[19] 吳 薇，蓋寶川，籍保平.紅茶菌混合菌種的分離與鑒定[J].食品科學，2004，25（4）：55-58.

[20] 段海婧，韓 婷，吳秀麗，等.荒漠植物牛心樸子內生真菌的分離與鑒定[J].中國中藥雜志，2013，38（3）：325-329.

[21] 俞 超，羅胡科，齊 娜，等.蛇足石杉內生真菌的分離純化與鑒定研究[J].江蘇農業科學，2009（3）：381-384.

[22] 陳賢興，陳析豐，南旭陽，等.喜樹果內生真菌的分離與鑒定[J].河南科學，2003，21（4）：431-433.

[23] 李能章，彭遠義.一株蘆薈抗菌內生細菌的分離鑒定及生物學性質研究[J].生物技術通訊，2004，15（2）：141-145.

[24] 王利娟，賀新生.植物內生真菌分離培養的研究方法[J].微生物學雜志，2006，26（4）：55-60.

[25] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上海科學技術出版社，1979.