四君子湯對過敏性紫癜患兒循環內皮祖細胞和腫瘤壞死因子α的影響

王旭輝　劉永紅　李哲敏　郭順紅　李紅霞　劉俊峰

[摘要] 目的 探討四君子湯對過敏性紫癜（HSP）患兒循環內皮祖細胞（EPC）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的影響。 方法 采用隨機數字表法將2014年1月～2015年9月于華北石油總醫院（以下簡稱“我院”）兒科門診確診的30例HSP患兒隨機分為兩組：實驗組和對照組，每組15例，對照組給予常規治療，實驗組在此基礎上加用四君子湯治療，同時選取我院體檢中心體檢的15名健康兒童作為正常組。治療前和治療后1周，分別檢測EPC數量和功能以及血清TNF-α水平。 結果 治療前實驗組和對照組循環EPC數量和TNF-α水平均明顯高于正常組（P < 0.01），而EPC功能則顯著下調（均P < 0.01）。經治療1周后，實驗組和對照組循環EPC數量、功能和TNF-α水平均有所恢復。相比之下，實驗組的恢復程度較對照組更為明顯，且與正常組差異無統計學意義（P > 0.05）。 結論 在常規治療的基礎上加用四君子湯能夠更快地促進HSP患兒循環EPC和TNF-α的恢復。

[關鍵詞] 過敏性紫癜；內皮祖細胞；腫瘤壞死因子α；四君子湯

[中圖分類號] R725.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）03（a）-0100-04

Department of Examination Center， the General Hospital of North China Oil Field， Hebei Province， Renqiu 062552， China

[Abstract] Objective To assess the effects of Sijunzi Decoction for circulating endothelial progenitor cell （EPC） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） in children with Henoch-Sch nlein purpura （HSP）. Methods Thirty children with HSP diagnosed in Department of Pediatrics of the General Hospital of North China Oil Field （"our hospital" for short） from January 2014 to September 2015 were randomly divided into two groups by random number table method： experimental group and control group， with 15 cases in each group. The children in control group were received conventional therapy， and the children in the experimental group were received Sijunzi Decoction， besides conventional therapy. Meanwhile， 15 healthy children from Department of Examination Center of our hospital were selected as the normal group. Before treatment and 1 week after treatment， the number and function of circulating EPC and levels of serum TNF-α were assessed. Results The number of circulating EPC and levels of serum TNF-α were all increased in the experimental group and control group compared with those in the normal group （P < 0.01）， but the function of circulating EPC was down regulated （all P < 0.01）. One week after therapy， the number and function of circulating EPC and levels of serum TNF-α were all recovered in the experimental group and control group. The degree of recovery in the experimental group was more evident than control group， and no difference could be observed in the experimental group and the normal group （all P > 0.05）. Conclusion In addition to conventional therapy in the children with HSP， Sijunzi Decoction can accelerate the recovery of circulating EPC and TNF-α.

[Key words] Henoch-Sch nlein purpura； Endothelial progenitor cell； Tumor necrosis factor-α； Sijunzi Decoction

過敏性紫癜（Henoch-Sch nlein purpura，HSP）是由免疫復合物介導的全身性血管炎性疾病[1]，并且已經成為兒童繼發性腎臟疾病的主要原因[2]。盡管發病機制尚不完全明晰，但是，作為血管損傷修復關鍵因素的內皮祖細胞（endothelial progenitor cell，EPC）[3]以及炎癥性細胞因子[4]在HSP發病中的作用已經逐漸被人們所認識，其不僅參與了HSP的發生發展過程，并且與HSP腎損害密切相關。鑒于四君子湯特有的免疫調節作用[5]，本研究在常規治療的基礎上加用四君子湯對HSP患兒進行治療，并對治療前后的循環EPC和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）進行了檢測，為其臨床廣泛應用提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月～2015年9月于華北石油總醫院（以下簡稱“我院”）兒科門診確診的30例HSP患兒為研究對象，所有患兒均以皮膚紫癜、關節腫痛為主要臨床表現，經實驗室及影像學檢查排除相關疾病后確診為HSP[6]。本次受試患兒中男16例，女14例；年齡2～7歲，平均（4.6±2.1）歲；平均病程（6.5±2.1）d。采用隨機數字表法將其分成對照組和實驗組，每組15例。其中對照組男8例，女7例；年齡（4.3±1.9）歲；病程（6.7±2.3）d。實驗組男7例，女8例；年齡（4.8±2.2）歲；病程（6.4±2.1）d。兩組一般資料比較差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。同時選取于我院體檢中心進行健康體檢的同齡健康兒童15名作為正常組，其中男8名，女7名，年齡（4.5±2.3）歲，與HSP患兒在性別和年齡上差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。本研究經醫院倫理委員會通過，所有患兒家長均知情同意。

1.2 方法

對照組在確診后即給予馬來酸氯苯那敏、山莨菪堿片、西咪替丁、維生素C常規口服治療，治療組在此基礎上加用四君子湯口服。四君子湯組方為：白術、人參、茯苓各5 g，炙甘草2 g，加清水80 mL文火煎至20 mL，每次口服10 mL，每日2 次，療程為1周。

1.3 檢測指標

清晨空腹經肘正中靜脈采集外周血10 mL，分別行相關檢測。

1.3.1 血清TNF-α 取外周血3 mL，應用德國Hanau公司Heraeus離心機（離心半徑3.0 cm）1500 r/min離心15 min分離血清，采用酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測，應用美國Peprotech公司的TNF-α檢測試劑盒并按其說明書操作。

1.3.2 循環EPC數量 取EDTA抗凝的外周血1 mL，以200 μL加入FITC標記的KDR（美國BD公司）、PE標記的CD34（美國BD公司）各5 μL，避光孵育20 min，經紅細胞裂解、2%多聚甲醛固定后，應用流式細胞儀檢測CD34和KDR雙陽性EPC的數量。

1.3.3 循環EPC體外培養和鑒定[7] 取外周血5 mL，應用淋巴細胞分離液（天津TBD公司）分離單個核細胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌、離心（離心半徑3.0 cm，1500 r/min，離心5 min）2次后，加入內皮細胞培養基-2（EGM-2，瑞士Lonza公司）將細胞密度調整為1×107/mL，并接種至纖維連結蛋白（fibronectin，美國Hematological Technologies公司）包被的24孔板中，在37℃、5%CO2條件下進行細胞培養。第7天通過免疫熒光法對EPC進行檢測，方法：加入5 mg/L DiI標記的乙酰化低密度脂蛋白（DiI-acLDL，美國Molecular Probes公司）培養4 h。吸棄培養基，加入2%多聚甲醛固定15 min，PBS反復洗滌5遍后，加入5 mg/L FITC標記的血凝素（FITC-lectin，美國Sigma公司）0.2 mL，37℃孵育1 h。經PBS反復沖洗后用德國Leica公司的TC-SP激光共聚焦顯微鏡進行檢測。雙熒光陽性的細胞即EPC。

1.3.4 EPC增殖能力 0.25%胰蛋白酶消化EPC，經EGM-2重懸并調整為1×105/mL，96孔板每孔加入細胞懸液0.2 mL，37℃、5%CO2條件下培養92 h，加入噻唑藍（MTT，美國Duchfo公司，5 mg/mL）20 μL繼續培養4 h。吸棄培養基，加入100 μL 二甲亞砜，振蕩2 min后用美國BIO-RAD公司的Model 680酶標儀檢測570 nm處的吸光度（A值）。

1.3.5 黏附能力 0.25%胰蛋白酶消化EPC，經EGM-2重懸并調整密度為5×104/mL，24孔板每孔加入EPC懸液1 mL，在37℃、5%CO2條件下培養30 min。PBS沖洗3遍后，于200×相差顯微鏡（型號：CKX31，日本Olympus公司）下進行EPC計數。

1.3.6 細胞遷移能力 0.25%胰蛋白酶消化EPC，并用EGM-2培養基（含0.1%胎牛血清，無細胞因子）調整密度為5×104/mL。取0.2 mL加入Trans-well中，并置入含0.6 mL EGM-2培養基的24孔板中，37℃、5%CO2條件下培養24 h。取出Trans-well，去除內層EPC后對外層EPC用2%多聚甲醛固定，經結晶紫染色后在200倍相差顯微鏡下進行EPC計數。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件包進行統計學處理。計量資料用均數±標準差（x±s）表示，多個樣本之間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法；兩個樣本之間的比較采用t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清TNF-α水平

實驗組和對照組患兒治療前血清TNF-α水平均明顯高于正常組（P < 0.01），并且實驗組和對照組之間差異無統計學意義（P > 0.05）。治療1周后，實驗組和對照組患兒血清TNF-α水平均有不同程度的下降（均P < 0.01），相比之下，實驗組較對照組下降更為明顯（P < 0.01），且與正常組之間的差異已無統計學意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 循環EPC數量的變化

治療前實驗組和對照組患兒循環EPC數量均明顯高于正常組（P < 0.05），并且實驗組和對照組之間差異無統計學意義（P > 0.05）。治療1周后，實驗組患兒循環EPC數量均有不同程度的下降，相比之下，實驗組較對照組下降更為明顯（P < 0.05），并且實驗組治療前后差異有統計學意義（P < 0.05），而對照組治療前后差異無統計學意義（P > 0.05）。同時，實驗組治療后與正常組之間差異無統計學意義（P > 0.05）。見表2。

2.3 循環EPC功能的變化

治療前實驗組和對照組患兒循環EPC體外的增殖、黏附和遷移能力均明顯低于正常組（P < 0.01），并且實驗組和對照組之間差異無統計學意義（P > 0.05）。治療1周后，實驗組和對照組患兒循環EPC體外功能指標均有不同程度的改善，其中增殖和遷移能力各組之間差異統計學意義（P > 0.05）。但黏附實驗顯示對照組仍略低于實驗組和正常組（P < 0.05），而實驗組與正常組之間差異無統計學意義（P > 0.05）。見表3。3 討論

HSP是一種以小血管炎為主要病理特征的變態反應性疾病[8]，通常累及毛細血管，造成其滲透性和脆性增加[9]。該病易反復發作[10]，進而造成腎臟的損害[11]。紫癜性腎炎是HSP較為嚴重且持久的并發癥[12]，主要的病理特征為彌漫性的小血管炎及腎間質的損害[13]。通常認為，作為內皮細胞前體的EPC在血管內皮損傷修復及血管新生的過程中發揮著重要的作用。一旦出現急性血管損傷，機體會通過動員骨髓EPC入血，增加循環EPC的數量并促進其歸巢至損傷發生的部位，發揮其修復作用[14]。而在HSP的進程中，免疫炎性反應在造成血管內皮損傷[15]的同時，盡管會促進機體循環EPC數量的增加，但同時也會抑制EPC的功能[3]，使其在血管內皮損傷修復上的作用不能得到充分有效的發揮。若該效應反復或持續存在，便會造成紫癜性腎炎的發生。TNF-α作為重要的炎癥性因子，可以對體內的免疫反應發揮重要的調節作用。此外，TNF-α還可以直接或協同其他細胞因子作用于腎臟[16]，造成腎臟血流動力學和內皮細胞結構的改變，抑制內皮細胞生長，引起腎小球毛細血管壁通透性的增加[17]。較高濃度的TNF-α還能夠誘導血管內皮細胞凋亡和血管壁的損傷[18]，并造成循環EPC功能的下調，從而加重腎臟病變。

四君子湯由人參、白術、茯苓、炙甘草組成[19]，具有健脾益氣功效，為治療脾氣虛證經典方劑[20]。方中人參補益中氣，健脾和胃為君；白術溫脾燥濕為臣；佐以茯苓甘淡滲濕健脾，使以甘草養胃和中。全方共奏健脾和胃、益氣養血之功效。近來有研究證明四君子湯還具有減輕氧化應激、抑制免疫炎性反應的作用[5]。因此本研究應用四君子湯對HSP進行治療，正是利用其進行免疫調節，改善免疫功能。本研究結果表明，在HSP的治療過程中，在常規治療的基礎上加用四君子湯口服，不僅能夠更為迅速地抑制體內的免疫炎性反應，減少以TNF-α為代表的炎癥性細胞因子的生成和釋放，同時循環EPC的各項功能指標也能夠更為迅速地上調至正常水平，從而有效地發揮對血管內皮損傷的修復作用。在這樣的作用效應背景下，循環EPC在完成受損血管內皮的修復工作后，其在外周血中的數量也就能夠更快地回調至正常水平。

由此可見，在常規治療的基礎上加用四君子湯對HSP進行治療，對于抑制免疫炎性反應和循環EPC異常所造成的血管病變的進展，促進疾病的迅速康復能夠起到積極的作用，因此值得在臨床中加以推廣。然而，值得注意的是，氧化應激和炎性反應是由復雜的、多通路的細胞因子網絡構成，同時，對于四君子湯的免疫調節機制及其具體的信號途徑，目前尚無相關研究予以明確闡釋，四君子湯在對HSP的治療過程中是通過什么信號通路抑制炎癥細胞因子的釋放還需要進一步深入研究。

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（收稿日期：2015-12-03 本文編輯：張瑜杰）