六月雪水提取物對乙醇損傷的人胃黏膜上皮細胞的保護作用

李洪亮　許仙赟　范小娜

摘要：前期研究發(fā)現(xiàn)六月雪[Serissa serissoides （DC.） Druce]對乙醇誘導的大鼠胃黏膜損傷有良好的保護作用，因此進一步在細胞水平上探討六月雪水提取物對乙醇損傷的人胃黏膜上皮細胞的保護作用。采用體外細胞培養(yǎng)人胃黏膜上皮細胞系GES-1細胞，將GES-1細胞用0～10%的乙醇孵育4～6 h，建立胃黏膜損傷模型。將參試GES-1細胞分為正常組、模型組、荊花胃康膠丸組、六月雪水提取物劑量組，正常組不做任何處理培養(yǎng)24 h，其他組加入一定濃度的乙醇處理一段時間后，加入含荊花胃康膠丸、六月雪水提取物各濃度劑量的培養(yǎng)基，正常組、模型組不加入藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，利用MTT檢測各組GES-1細胞的活性。將MTT篩選后效果最佳的六月雪3個濃度以及荊花胃康膠丸組1個濃度分別定為高、中、低劑量組和陽性藥物組，運用吖啶橙熒光染色法檢測各組細胞凋亡情況，采用Western-Blot 法檢測各試驗組堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）蛋白的表達情況。結果表明，5%的乙醇孵育GES-1細胞4 h是造成胃黏膜損傷的最佳細胞模型，對GES-1細胞的抑制率達到40%。六月雪水提取物組中，60、70、80 μg/mL 3個濃度效果最佳，與該組其他濃度比較差異顯著（P<0.05）；荊花胃康膠丸組中，在濃度為160 μg/mL 時細胞增殖最明顯；均高于其他濃度的荊花胃康膠丸組；吖啶橙染色后顯微鏡下觀察正常GES-1細胞形態(tài)均一、生長良好，而模型組大量細胞明顯出現(xiàn)衰老或凋亡，荊花胃康膠丸組、六月雪水提取物組GES-1細胞生長情況明顯好于模型組；模型組bFGF的蛋白表達水平明顯高于正常組，差異顯著（P<0.05）；與模型組比較，六月雪水提取物組的bFGF蛋白表達水平明顯增加，差異極顯著（P<0.01）；六月雪水提取物組與荊花胃康膠丸組比較，bFGF的表達水平差異也達極顯著水平（P<0.01）。 說明六月雪水提取物可以保護乙醇損傷的人胃黏膜上皮系GES-1細胞，可以增加bFGF的蛋白表達水平，提高潰瘍愈合速度。

關鍵詞：六月雪；水提取物；乙醇；人胃黏膜上皮細胞

中圖分類號：Q949.781.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）08-2035-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.08.029

Abstract： Previous research found that junesnow[Serissa serissoides （DC.） Druce] has protect effect on gastric mucosal damage of rat caused by alcohol， further research was conducted on cellular level to explore the protect effect of junesnow on human gastric mucosal epithelial cells injured by alcohol. Epithelial cells GES-1 was cultured in vitro， then incubated under alcohol stress（0～10%） for 4～6 h to set gastric mucosal damage model. The experimental cell were divided into normal group， model group， Jinghuawenkang group and Junesnow group. Normal group was cultured for 24 h without any treatment； while the rest groups were treated by alcohol for certain time and then cultured with medium adding different dose of Jinghuawenkan or junesnow for 24 h. MTT experiment was used to exam the cell activity of each group. The results were taken to confirm high， meddle， low dosage of junesnow and positive drug group of Jinghuawenkang. Acridine orange staining method was used to measure apoptosis of each group； and Western-Blot to measure expression of bFGF. Results showed that incubating GES-1 in 5% alcohol for 4 h could establish the best gastric mucosal damage model as the inhibitory rate of cell could reach to 40%. In Junesnow group， 60， 70， 80 μg/mL treatments had the best effect （P<0.05）. In Jinghuawenkang group， the cell reproduced the most obviously in 160 μg/mL treatment， higher than other Jinghuawenkang treatments. After acridine orange staining， the normal GES-1 cells showed uniform morphology and well growth status； while the model group cells were obviously senescent or apoptosis. The cells of Junesnow and Jinghuawenkang groups grew better than model group. The expression level of bFGF in model group is significantly higher than in normal group（P<0.05）. he expression level of bFGF in Junesnow group is very significantly higher than in model group（P<0.01） and Jinghuawenkang group（P<0.01）. The junesnow can protect human gastric mucosal epithelial cells injured by alcohol， can increase the expression of bFGF to improve the ulcer healing rate.

Key words： junesnow [Serissa serissoides （DC.） Druce]；water extract；ethanol；human gastric mucosal epithelial cells

隨著人們生活水平的提高，飲酒成了日常生活中十分普遍的現(xiàn)象，但由乙醇引起的消化道疾病則呈逐年增加趨勢，大量飲酒可引起急性的消化道患疾，主要有胃炎、胃潰瘍等胃腸道疾病。乙醇對胃黏膜損傷機制非常復雜，主要有化學灼傷及誘導胃黏膜細胞凋亡、壞死等[1]。中藥六月雪又名白馬骨，系茜草科（Rubiaceae）植物六月雪[Serissa serissoides（DC.）Druce]的干燥全草[2]。全國各地均產。在江西省贛南地區(qū)資源豐富。為常用民間草藥。六月雪早在《本草拾遺》中就有記載，其能活血、涼血、疏肝瀉濕、消腫止痛[3]。現(xiàn)代醫(yī)學主要用于急慢性肝炎、黃疸、流行性腮腺炎、腎性水腫、血尿及高血壓等癥[4]。六月雪水提取物對乙醇所致的大鼠胃黏膜損傷有保護作用，能明顯減少潰瘍面積的發(fā)生；而且六月雪、黃花倒水蓮聯(lián)合用藥對無水乙醇、阿司匹林、鹽酸所致的大鼠胃黏膜損傷有明顯的保護作用，并且有一定的抗炎、促血小板生成、促凝血作用，作用機制可能和凝血因子以及調節(jié)激素水平有關[5-7]。2013年7月至2014年6月，在前期實驗動物大鼠研究的基礎上，課題組采用乙醇損傷的人胃黏膜上皮細胞為模型，以細胞活性、細胞凋亡、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）為檢測指標，觀察六月雪水提取物對乙醇造成的人胃黏膜上皮細胞損傷的保護效果，進一步在細胞水平上探討了六月雪對胃黏膜細胞保護的作用機制，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人胃黏膜上皮細胞系GES-1細胞由贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院饋贈。

1.1.2 試（藥）劑 中藥炮制品六月雪購自贛州市醫(yī)藥公司，經鑒定為正品；荊花胃康膠丸，由天津天士力制藥股份有限公司生產，批號：20130916；吖啶橙（AO）、高糖培養(yǎng)基DMEM、胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）、噻唑藍（MTT）為美國Sigma公司產品；胎牛血清由杭州四季青公司提供；一抗bFGF兔抗人多克隆抗體、二抗羊抗兔辣根過氧化物酶抗體、β-acting蛋白由上海長島生物技術開發(fā)有限公司提供；PVDF膜為美國Millipore公司產品。還有乙醇、NaOH、磷酸鹽緩沖液（PBS）、CO2等。

1.1.3 儀器 主要有Olympus CK40熒光倒置顯微鏡（日本光學工業(yè)株式會社）、CO2培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司）、Thermo-354酶標儀（美國熱電公司）、電泳系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板（美國Corning公司）等。

1.2 方法

1.2.1 樣品溶液的制備 取干燥六月雪藥材500 g，加去離子水，過液面2 cm，煮沸2次，30 min/次，濃縮至400 mL，加3倍量的95%乙醇，放冰箱靜置過夜，次日減壓過濾，并回收濾液中乙醇，繼續(xù)濃縮濾液得無醇味的提取物。提取物加去離子水至500 mL，使藥液為相當于生藥復方1 g/mL，用0.5% NaOH調整pH為7.0，置冰箱中備用。

1.2.2 GES-1細胞損傷模型的建立 分別以含0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%乙醇濃度的培養(yǎng)液作用人胃黏膜上皮細胞系GES-1細胞，作用時間分別為2、3、4、5、6 h，分別觀察造成GES-1細胞損傷的程度，MTT法檢測到的GES-1細胞抑制率達到40%左右時的試驗參數即可作為最佳的GES-1細胞損傷模型，此時MTT法測得的吸光度值（OD值）在0～0.7范圍內。后面的試驗均以建模最佳乙醇濃度及作用時間制作GES-1細胞損傷模型。

1.2.3 GES-1細胞分組及處理 將參試GES-1細胞分為正常組（對照）、模型組、荊花胃康膠丸組、六月雪水提取物組4個組。處理過程如下：將GES-1細胞復蘇，取對數生長期細胞，調整細胞密度為5×103/mL，按照每孔100 μL 接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h；貼壁后，吸出上清液，PBS洗2次。正常組GES-1細胞加入完全培養(yǎng)基，其余加入篩選出的乙醇濃度孵育一定時間后吸出的上清液，PBS洗2次。最后將六月雪水提取物組、荊花胃康膠丸組GES-1細胞加入含不同濃度的相應藥物培養(yǎng)基100 μL，正常組、模型組不加藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 MTT檢測GES-1細胞活性 將六月雪水提取物組和荊花胃康膠丸組分別換上含不同濃度六月雪（10、20、30、40、50、60、70、80、100 μg/mL）和荊花胃康膠丸（10、40、80、120、160、200、240、280 μg/mL）的培養(yǎng)液100 μL，正常組加入無藥物培養(yǎng)基100 μL，每組5個重復孔，各組分別培養(yǎng)24 h后，加入5 % MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸出培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 100 μL，振蕩溶解10 min。用酶標儀檢測吸光度值（OD值），檢測波長490 nm，應用MTT比色法計算GES-1細胞活性。

1.2.5 吖啶橙熒光染色檢測GES-1細胞凋亡 選擇效果最佳的六月雪3個梯度劑量作為高、中、低劑量，選擇最佳效果劑量的荊花胃康膠丸組作為陽性對照，正常組（對照）、模型組處理同上，將各組制備成GES-1細胞爬片，無菌PBS溶液洗去培養(yǎng)液，用95%乙醇固定液固定15 min，放置稍干燥后，滴加AO染液，避光靜置2～3 min。將附有單層細胞染色后的小蓋玻片反置于載玻片上，以濾紙吸取蓋玻片周圍的多余液體。使用相應的濾光片（綠光激發(fā)），用熒光顯微鏡觀察，凋亡的GES-1細胞呈現(xiàn)為染色減弱、熒光較亮、均勻一致的圓狀或固縮狀、團塊狀結構，而非凋亡細胞核呈現(xiàn)熒光深淺不一的結構樣特征。

1.2.6 Westernblot 檢測bFGF蛋白的表達 分組同1.2.4，細胞培養(yǎng)6孔板中每4孔為一個樣本，收集各組GES-1細胞上清液后，用PBS沖洗1次，棄去PBS，胰蛋白酶消化并收集GES-1細胞，加入細胞裂解液，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取上清液，即是細胞總蛋白，Bradford法進行蛋白含量測定。制備的蛋白樣本進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后用電轉膜法將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，一抗為bFGF抗體，二抗為羊抗兔辣根過氧化物酶抗體，β-acting蛋白作為對照。利用ECL化學發(fā)光法進行顯色反應。檢測結果以X線膠片曝光。用美國image J成像系統(tǒng)軟件對條帶進行灰度值掃描，以bFGF蛋白條帶的灰度值與β-acting內參的灰度值之比作為蛋白的相對表達量。

1.3 數據處理

試驗所得數據用x±S表示，采用Prism4.0統(tǒng)計軟件進行分析，用配對t檢驗法進行組間差別比較。

2 結果與分析

2.1 GES-1細胞損傷模型選擇

不同濃度乙醇作用GES-1細胞后在不同時間段的MTT法檢測結果見表1。從表1可見，不同濃度乙醇作用后均對GES-1細胞造成損傷，其中5%的乙醇孵育4 h對GES-1細胞的抑制率達到40%，符合試驗要求，表明5%的乙醇孵育4 h是最佳的GES-1細胞損傷模型。

2.2 各組細胞活性檢測

正常組、荊花胃康膠丸組、六月雪水提取物組的GES-1細胞加入篩選出的乙醇濃度孵育后，經培養(yǎng)，測得的各組GES-1細胞OD值結果見表2。從表2可見，六月雪水提取物組GES-1細胞的增殖與濃度呈劑量依賴性，在10～60 μg/mL時增殖活性較明顯，60～80 μg/mL時增殖速率有所減慢，但仍然呈現(xiàn)遞增趨勢，到100 μg/mL時呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是高濃度的六月雪水提取物對GES-1細胞產生了不良反應造成的。在荊花胃康膠丸組中，當濃度在160 μg/mL時，GES-1細胞增殖最明顯，同時由于藥物毒性，在劑量高于160 μg/mL時，GES-1細胞增殖開始減弱。

2.3 吖啶橙熒光染色

正常組（對照）、模型組、荊花胃康膠丸組（陽性對照）和六月雪水提取物高劑量組（80 μg/mL）、中劑量組（70 μg/mL）、低劑量組（60 μg/mL）分別用吖啶橙熒光染色后，于Olympus CK40熒光倒置顯微鏡下觀察，并拍照，結果見圖1。從圖1A可見，正常對照組在顯微鏡下觀察的GES-1細胞形態(tài)均一，細胞生長良好，吖啶橙染色后細胞核呈現(xiàn)熒光深淺不一的結構樣特征，在熒光20倍下觀察，整個視野未出現(xiàn)大量凋亡細胞。從圖1B可見，模型組的GES-1細胞在乙醇作用下，大量GES-1細胞出現(xiàn)明顯的衰老或凋亡，在熒光20倍下觀察，能夠觀察到大量的凋亡細胞，凋亡細胞染色增強、熒光較亮、均勻一致地呈圓狀或固縮狀。從圖1C可見，荊花胃康膠丸組（160 μg/mL）的GES-1細胞生長情況明顯好于模型組。從圖1D、圖1E、圖1F可見，六月雪水提取物高、中、低劑量組的GES-1細胞生長情況也明顯好于模型組。

2.4 bFGF蛋白的表達

Westernblot檢測bFGF蛋白的相對表達情況見圖2。從圖2可見，模型組bFGF的蛋白相對表達水平高于正常組，2組之間差異顯著（P<0.05）。與模型組和荊花胃康膠丸組比較，六月雪水提取物的高、中、低劑量組中bFGF的蛋白相對表達均大幅增加，高、中、低劑量組與模型組、荊花胃康膠丸組之間差異極顯著（P<0.01））。并且六月雪水提取物低劑量組的bFGF蛋白相對表達較高、中劑量組bFGF的蛋白相對表達水平有所減弱。

3 討論

GES-1細胞來源于人胃黏膜上皮，該細胞能在體外穩(wěn)定傳代，目前乙醇損傷的GES-1細胞模型在大量的基礎研究中被廣泛應用，并證明其為良好的實用型實驗細胞模型[6]。試驗結果表明，正常細胞生長良好，不同濃度乙醇作用GES-1細胞不同時間后會出現(xiàn)不同程度的損傷，其中5%的乙醇孵育4 h對GES-1細胞的抑制率達到40%，表明建模成功，且與臨床中酒精所致的胃黏膜損傷相近，并且重現(xiàn)試驗證明該方法簡單、穩(wěn)定性高。

六月雪在江西省贛南18個縣均有分布、資源十分豐富，六月雪水提取物在贛南民間常用作酒精性胃出血的治療，并且效果十分顯著。前期研究[7]發(fā)現(xiàn)六月雪水提取物單獨用藥對乙醇誘導的大鼠胃黏膜損傷有明顯的修復作用，能降低潰瘍面積指數；并且六月雪與黃花倒水蓮聯(lián)合用藥對無水乙醇、阿司匹林、鹽酸致大鼠胃黏膜損傷有明顯的保護作用，還有一定的抗炎、促血小板生成、促凝血作用，作用機制可能和凝血因子以及調節(jié)激素水平有關[5，7]。有文獻[8，9]報道了荊花胃康膠丸對急慢性胃炎、消化性潰瘍有較好的治療效果，選擇其作為陽性對照藥物療效穩(wěn)定性較高。試驗利用六月雪水提取物作用于人胃潰瘍模型的GES-1細胞，結果表明，六月雪水提取物對乙醇損傷的GES-1細胞均有促進增殖的作用，但是藥劑量逐漸增大到一定程度后對細胞的毒性也逐漸增大。吖啶橙熒光染色結果表明，GES-1細胞經乙醇作用后，能夠觀察到大量的凋亡細胞，凋亡細胞染色增強、熒光較亮、均勻一致的呈圓狀或固縮狀，其中荊花胃康膠丸組、六月雪水提取物組的GES-1細胞生長情況明顯好于模型組。

正常胃黏膜組織中bFGF蛋白表達呈弱陽性；大量研究認為，當胃潰瘍發(fā)生時，bFGF蛋白呈陽性表達，胃潰瘍組織中bFGF表達高于正常的胃黏膜，在愈合期和瘢痕期均呈強陽性表達，但在愈合階段其表達逐漸減弱[10]。試驗通過免疫印跡分析bFGF結果可知，bFGF在正常組中有少量表達，在模型組和給藥組中表達非常顯著，與正常組比較差異顯著（P<0.05）。bFGF在胃潰瘍愈合過程中的表達由弱到強，推測可能與潰瘍愈合有關，低劑量六月雪水提取物組的bFGF表達較高、中劑量組有所減少，但仍呈高表達狀態(tài)，這可能與細胞處于瘢痕期，其組織結構仍需要調整、仍然需要bFGF的作用有關，綜上所述，六月雪水提取物對乙醇損傷GES-1細胞有保護作用，這為中藥治療乙醇導致的消化性潰瘍開辟了一條新的路徑。

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