鞘內(nèi)注射Caspase—6抑制劑Z—VEID—FMK對(duì)小鼠福爾馬林炎性痛的影響

殷智宇 楚帥帥 孫青 李璐 顧小萍 馬正良

[摘要] 目的 研究鞘內(nèi)注射Caspase-6抑制劑Z-VEID-FMK對(duì)小鼠福爾馬林炎性痛的影響。 方法 采用小鼠右后足底皮內(nèi)注射5%福爾馬林溶液建立疼痛模型，32只小鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分成四組：空白組、溶媒組、低劑量組和高劑量組，每組8只。空白組僅建立疼痛模型，溶媒組、低劑量組和高劑量組分別鞘內(nèi)注射20%二甲基亞砜（DMSO）、5 μg Z-VEID-FMK和10 μg Z-VEID-FMK，給藥體積為5 μL，隨后建立疼痛模型。觀察福爾馬林炎性痛小鼠舔/咬腳時(shí)間，比較模型建立前及建立后60 min小鼠足底的厚度。 結(jié)果 各組小鼠足底皮內(nèi)注射福爾馬林后均出現(xiàn)明顯的雙時(shí)相疼痛反應(yīng)，在一相痛中，低劑量組[（88.88±6.98）s]、高劑量組[（90.09±8.49）s]與溶媒組[（90.50±11.18）s]小鼠舔/咬腳時(shí)間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；在二相痛中，與溶媒組[（220.25±80.80）s]比較，低劑量組[（81.25±14.10）s]、高劑量組[（50.63±10.77）s]小鼠舔/咬腳時(shí)間均顯著縮短，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。與溶媒組[（1.78±0.02）mm]比較，低劑量組[（1.31±0.07）mm]及高劑量組[（1.11±0.08）mm]小鼠足底腫脹顯著降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 Caspase-6抑制劑Z-VEID-FMK可以緩解小鼠福爾馬林炎性痛，可能與其抑制炎性因子作用有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] Caspase-6；Z-VEID-FMK；福爾馬林炎性痛；足底厚度

[中圖分類(lèi)號(hào)] R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）03（c）-0031-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of intrathecal injection Caspase-6 inhibitor Z-VEID-FMK on mice with formalin inflammatory pain. Methods The pain model was established by subcutaneous injection 5% formalin in mouse′ right plantar. 32 mice were divided into four groups： control group， vehicle group， low-dose group， high-dose group according to random number table method， each group had 8 mice. Pain model was established only in control group. Vehicle group， low-dose group and high dose group was intrathecal injected 20% DMSO， 5 μg Z-VEID-FMK and 10 μg Z-VEID-FMK （the volume was 5 μL） respectively， followed by the establishment of pain model. The mice licking/biting foot time with formalin inflammatory pain was observed. Meanwhile， the foot thickness of mice before and 60 min after establishment of formalin pain model was compared. Results All mice displayed apparent dual-phase pain response after subcutaneously injected formalin. In phase-1， there were no significant differences on mice licking/biting foot times among low-dose group [（88.88±6.98） s]， high dose group [（90.09±8.49） s] and vehicle group [（90.50±11.18） s] （P > 0.05）. In phase-2， compared with vehicle group [（220.25±80.80） s]， mice licking/biting foot times of low-dose group [（81.25±14.10） s] and high-dose group [（50.63±10.77） s] were significantly shorten， with statistical differences （P < 0.01）. Compared with vehicle group [（1.78±0.02） mm]， plantar thickness of mice in low-dose group [（1.31±0.07） mm] and high-dose group [（1.11±0.08） mm] were significantly reduced， with statistical differences （P < 0.01）. Conclusion Caspase-6 inhibitor Z-VEID-FMK can relieve formalin inflammatory pain and may be related to its anti-inflammatory effect.

[Key words] Caspase-6； Z-VEID-FMK； Formalin inflammatory pain； Plantar thickness

天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（cystein-containing aspartate-specific protease，Caspase）是半胱氨酸蛋白酶家族中的一員，在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、神經(jīng)退行性變及炎性反應(yīng)中有著重要的作用[1]。已有研究表明，Caspase家族中的Caspase-1和Caspase-3通過(guò)調(diào)節(jié)白介素（IL）-1β和神經(jīng)元凋亡參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生、發(fā)展[2]。Caspase-6屬于效應(yīng)Caspase分子，存在于神經(jīng)元軸突中，與神經(jīng)元軸突退行性變密切相關(guān)，在老年個(gè)體中，Caspase-6與阿爾茲海默病（AD）病理學(xué)及記憶力下降密切相關(guān)[3]，以往研究主要集中于AD等神經(jīng)變性疾病及腫瘤方面作用[4-5]，但在其他領(lǐng)域研究較少。Caspase-6在大腦組織和外周組織中有廣泛表達(dá)[6-7]。有實(shí)驗(yàn)研究顯示，Caspase-6蛋白存在于脊髓背角[8]，因此，推測(cè)Caspase-6參與了脊髓疼痛信號(hào)傳遞。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察鞘內(nèi)注射Caspase-6抑制劑Z-VEID-FMK對(duì)小鼠福爾馬林炎性痛的影響，初步探求Caspase-6在炎性疼痛中的作用，為進(jìn)一步驗(yàn)證Caspase-6參與脊髓疼痛信號(hào)傳遞提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

32只健康成年雄性ICR小鼠，6～8周，體重30～35 g，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供[動(dòng)物合格證號(hào)：SKXK（蘇）2012-0004]。飼養(yǎng)環(huán)境室溫控制在20～24℃，小鼠自由飲食，待適應(yīng)環(huán)境5 d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為空白組、溶媒組、低劑量組（5 μg Z-VEID-FMK）及高劑量組（10 μg Z-VEID-FMK），每組8只小鼠。空白組小鼠不注射藥物，溶媒組小鼠鞘內(nèi)注射20%二甲基亞砜（DMSO），低劑量組小鼠鞘內(nèi)注射5 μg Z-VEID-FMK，高劑量組小鼠鞘內(nèi)注射10 μg Z-VEID-FMK。給藥后10 min，小鼠右后足底皮內(nèi)注射5%福爾馬林溶液建立福爾馬林炎性痛模型。研究遵循有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用的指南，并經(jīng)單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法及觀察指標(biāo)

1.3.1 實(shí)驗(yàn)儀器及材料 Z-VEID-FMK（Caspase-6抑制劑，Sigma公司），DMSO（北京舒伯偉化工儀器有限責(zé)任公司），甲醛溶液（36%～37%，Sigma公司），千分尺（Deshen，中國(guó)，0.01 mm）。Z-VEID-FMK首先溶解于DMSO中，隨后用生理鹽水（NS）稀釋?zhuān)罱K溶劑濃度20%DMSO。取0.5 mL的甲醛溶液稀釋于9.5 mL的NS中，配成5%的福爾馬林溶液。

1.3.2 小鼠鞘內(nèi)注射方法 按壓小鼠腰骶兩側(cè)固定，自L4～L5棘突間進(jìn)針，以鼠尾突然出現(xiàn)側(cè)向運(yùn)動(dòng)為注射成功標(biāo)志。用微量進(jìn)樣器進(jìn)行注射，注射藥物容積為5 μL，注射時(shí)間10 s，留針10 s。

1.3.3 福爾馬林炎性痛模型制作及疼痛測(cè)定 福爾馬林實(shí)驗(yàn)根據(jù)Hunskaar等[9]描述的方法進(jìn)行，具體方法是將小鼠單獨(dú)置于玻璃燒杯中，使其適應(yīng)環(huán)境30 min，鞘內(nèi)注射藥物或溶媒后10 min，先固定小鼠，消毒小鼠右后肢，在右后足足底中部皮內(nèi)注射25 μL的5%福爾馬林溶液，使其局部產(chǎn)生紅、腫、熱、痛等炎性反應(yīng)，隨后將小鼠放置于燒杯中，在燒杯底下放一面鏡子以便清晰觀察小鼠的右后爪，用秒表記錄每5分鐘小鼠舔/咬腳的時(shí)間作為疼痛的指標(biāo)。

1.3.4 足底腫脹程度測(cè)定 根據(jù)Winter等[10]所描述的方法，測(cè)量小鼠福爾馬林足底腫脹厚度，作為藥物抗炎作用的指標(biāo)。小鼠足底皮內(nèi)注射福爾馬林（5%，25 μL）后注射部位產(chǎn)生水腫，測(cè)量福爾馬林注射前和注射后60 min足背-足底軸的厚度。腫脹程度計(jì)算：Δ腫脹=V2-V1（V1：足底注射福爾馬林前的厚度；V2：足底注射福爾馬林后的厚度）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用重復(fù)測(cè)量方差分析或單因素方差分析，兩兩比較采用post hoc分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鞘內(nèi)注射Z-VEID-FMK對(duì)小鼠福爾馬林炎性痛舔/咬腳時(shí)間的影響

小鼠模型建立后，0～5 min產(chǎn)生顯著的一相痛反應(yīng)，靜息期無(wú)顯著疼痛反應(yīng)；10～45 min產(chǎn)生顯著的二相痛。整體分析顯示：組間比較（F = 59.053，P < 0.01）、時(shí)間點(diǎn)比較（F = 157.037，P < 0.01）、分組與時(shí)間的交互作用比較（F = 5.209，P < 0.01）差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。精細(xì)比較：空白組與溶媒組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；福爾馬林注射后15～35 min，溶媒組、低劑量組、高劑量組兩兩比較，小鼠舔/咬腳時(shí)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；低劑量組及高劑量組舔/咬腳時(shí)間均短于空白組及溶媒組（P < 0.05），且高劑量組舔/咬腳時(shí)間短于低劑量組（P < 0.05）。見(jiàn)圖1。

在一相痛中，四組小鼠舔/咬腳時(shí)間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；在二相痛中，與空白組及溶媒組比較，低劑量組小鼠舔/咬腳時(shí)間顯著縮短，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），高劑量組小鼠舔/咬腳時(shí)間顯著縮短，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。低劑量組與高劑量組兩兩比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），說(shuō)明Z-VEID-FMK抑制小鼠福爾馬林炎性痛反應(yīng)的效果呈劑量依賴性。見(jiàn)表1。

2.2 鞘內(nèi)注射Z-VEID-FMK對(duì)小鼠福爾馬林炎性痛模型足底腫脹的影響

注射福爾馬林后，小鼠足底產(chǎn)生明顯紅腫，空白組及溶媒組小鼠的足底腫脹值分別為（1.78±0.04）、（1.78±0.02）mm，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。與溶媒組比較，低劑量組[（1.31±0.07）mm]、高劑量組[（1.11±0.08）mm]小鼠足底腫脹值顯著降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)圖2。

3 討論

Caspase成員具有相似的氨基酸序列、結(jié)構(gòu)和底物特異性，通常以酶原的形式存在。按效應(yīng)可分為兩類(lèi)：一類(lèi)是上游啟動(dòng)者Caspases，如Caspase-8、9，可裂解并激活其他Caspase；另一類(lèi)是下游效應(yīng)者Caspases，主要包括Caspase-3、6、7，可裂解各種底物，分解細(xì)胞結(jié)構(gòu)或使酶失活[11]。近年來(lái)，Caspase-6的重要作用逐漸被研究者發(fā)現(xiàn)，除了參與細(xì)胞凋亡外，在神經(jīng)退行性變、免疫炎癥、腫瘤、增殖等方面均有重要的作用。

足底皮內(nèi)注射福爾馬林是一個(gè)經(jīng)典的炎性痛模型，本實(shí)驗(yàn)小鼠注射福爾馬林后，注射足表現(xiàn)出縮腿、舔爪及顫抖等反應(yīng)，對(duì)傷害性刺激的行為學(xué)反應(yīng)的表現(xiàn)分為兩個(gè)不同的時(shí)間段，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，說(shuō)明福爾馬林小鼠致痛模型的復(fù)制是成功的[12]。一相痛為0～5 min，主要與福爾馬林對(duì)外周C纖維的直接刺激及神經(jīng)末梢釋放致痛物質(zhì)有關(guān)，屬于非炎性痛；二相痛為10～45 min，主要由外周及脊髓的炎性因子[例如IL-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α等]釋放產(chǎn)生，屬于炎性痛[13-14]。總的來(lái)說(shuō)，中樞性鎮(zhèn)痛藥可以抑制一相痛及二相痛，外周性鎮(zhèn)痛藥只能抑制二相痛[15]。溶媒組與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明鞘內(nèi)注射溶媒不影響小鼠疼痛行為。本研究結(jié)果顯示，鞘內(nèi)注射Z-VEID-FMK對(duì)小鼠一相痛沒(méi)有顯著影響，但是劑量依賴性地抑制二相痛，說(shuō)明Caspase-6主要參與了福爾馬林炎性痛的中樞敏化及炎性反應(yīng)的過(guò)程。傅開(kāi)元等[16]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠足底皮內(nèi)注射福爾馬林引起的炎性損傷可以導(dǎo)致脊髓角Fas/Fas-L途徑的神經(jīng)元凋亡。Woolf等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在外周神經(jīng)損傷的大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型中，脊髓背角淺層神經(jīng)元發(fā)生凋亡后留下空隙，脊髓深層未受到損傷的神經(jīng)纖維可通過(guò)芽生的方式，使軸突伸入脊髓背角淺層，與淺層的傷害性神經(jīng)元構(gòu)成新的突觸聯(lián)系，使傷害性刺激信息傳導(dǎo)通路發(fā)生異常放電，引起神經(jīng)興奮性升高，產(chǎn)生痛覺(jué)過(guò)敏或痛覺(jué)異常。Moore等[18]研究報(bào)道，外周損傷引起脊髓后角凋亡的神經(jīng)元可能為抑制性中間神經(jīng)元，而抑制性中間神經(jīng)元的減少使脊髓后角傳導(dǎo)痛覺(jué)的傷害性神經(jīng)元異常興奮，可表現(xiàn)為痛覺(jué)過(guò)敏。吳飛翔[19]研究顯示，與Caspase-6同為Caspase效應(yīng)酶的Caspase-3可通過(guò)增加TNF-α的表達(dá)從而增加細(xì)胞凋亡產(chǎn)生神經(jīng)病理性疼痛，因此推測(cè)Caspase-6或許通過(guò)增加炎癥介質(zhì)（IL-1β、TNF-α）釋放、活化膠質(zhì)細(xì)胞、誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡等參與福爾馬林炎性疼痛過(guò)程，具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，鞘內(nèi)注射Z-VEID-FMK可以劑量依賴性地抑制福爾馬林導(dǎo)致的小鼠足底腫脹。福爾馬林引起的足底局部組織水腫與某些炎癥介質(zhì)如組胺、緩激肽等介導(dǎo)血管擴(kuò)張與滲出有關(guān)[20]，在炎癥狀態(tài)下神經(jīng)末梢會(huì)分泌P物質(zhì)等神經(jīng)介質(zhì)，促進(jìn)局部血管擴(kuò)張，增加滲出，加重局部組織腫脹。抑制神經(jīng)末梢某些促炎性因子（IL-1β、TNF-α）或神經(jīng)介質(zhì)（P物質(zhì)）的釋放可能是鞘內(nèi)注射Z-VEID-FMK抑制足底腫脹的機(jī)制。

綜上所述，Caspase-6抑制劑Z-VEID-FMK可以緩解小鼠福爾馬林炎性痛，減輕小鼠足底腫脹，可能與其抑制炎性因子作用有關(guān)。

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（收稿日期：2015-12-06 本文編輯：李亞聰）