冬蟲夏草西洋參復合物增強免疫力功能實驗研究

邱涵 呂曉君 張鵬

[摘要] 目的 研究冬蟲夏草西洋參復合物對小鼠免疫功能的影響。 方法 將SPF級昆明種雌性小鼠200只隨機分為5個實驗組，每個實驗組動物分為陰性對照組和冬蟲夏草西洋參復合物高、中、低劑量組（0.9、0.6、0.3 g/kg）。陰性對照組給予蒸餾水，連續灌胃30 d，每日1次。檢測冬蟲夏草西洋參復合物對ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化能力、遲發型變態反應、血清溶血素水平、抗體生成細胞數、小鼠碳廓清能力、小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力及NK細胞活性等免疫指標的影響。 結果 與陰性對照組比較，冬蟲夏草西洋參復合物高、中、低劑量組能明顯促進小鼠遲發型變態反應（P < 0.01），升高血清溶血素水平（P < 0.05或P < 0.01）；冬蟲夏草西洋參復合物中、低劑量組可顯著提高碳廓清能力（P < 0.05或P < 0.01），高、中劑量組可顯著增強NK細胞活性（P < 0.05）；但冬蟲夏草西洋參復合物各劑量組對小鼠體重、胸腺/體重比值、脾臟/體重比值、脾淋巴細胞增值轉化能力、抗體生成細胞數及巨噬細胞吞噬雞紅細胞作用無明顯影響（P > 0.05）。 結論 冬蟲夏草西洋參復合物具有增強小鼠免疫力的功能。

[關鍵詞] 冬蟲夏草；西洋參；免疫功能；小鼠

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）03（c）-0018-05

[Abstract] Objective To study the impact of Cordyceps and Panacis Quinquefolii Radix Compound on immunity function in mice. Methods A total of 200 SPF Kunming female mice were randomly divided into 5 batches， each of which consisted of negative control group and high， medium and low dosage （0.9， 0.6， 0.3 g/kg） of Cordyceps and Panacis Quinquefolii Radix Compound group. The negative control group was given distilled water， each mouse was orally administered once a day， for 30 days. The immune indexes including ConA-induced lymphocyte transformation ability， delayed type hypersensitivity， serum hemolysin level， antibody producing cell count， carbon clearance ability， macrophage phagocytosis of chicken erythrocytes capacity and NK cell activity were detected. Results Compared with the negative control group， high， medium and low dosage of Cordyceps and Panacis Quinquefolii Radix Compound group could significantly strengthen the delayed type hypersensitivity of mice （P < 0.01）， increase the level of serum hemolysin （P < 0.05 or P < 0.01）. The medium and low dosage of Cordyceps and Panacis Quinquefolii Radix Compound group could significantly strengthen carbon clearance ability of mice （P < 0.05 or P < 0.01）， the high and medium dosage of Cordyceps and Panacis Quinquefolii Radix Compound group could significantly strengthen NK cells activity of mice （P < 0.05）. However， Cordyceps and Panacis Quinquefolii Radix Compound had no significant effects on body weight increase， ratio of spleen weight to body weight， ratio of thymus weight to body weight， lymphocyte transformation ability of mice induced by ConA and macrophage phagocytosis of chicken erythrocytes capacity （P > 0.05）. Conclusion Cordyceps and Panacis Quinquefolii Radix Compound can enhance immunity function in mice.

[Key words] Cordyceps； Panacis Quinquefolii Radix； Immunity function； Mice

冬蟲夏草，又名蟲草，是我國特有的珍稀名貴藥材，其主要化學成分中的腺苷和多糖是冬蟲夏草生理活性最顯著的物質，研究提示冬蟲夏草多糖和腺苷具有增強免疫力的作用[1-2]。西洋參，又名西洋人參、洋參、花旗參、廣東人參，其主要化學成分中的西洋參皂苷是生理活性最顯著的物質，研究提示，西洋參皂苷和多糖等成分具有增強免疫力的作用[3-5]。傳統中醫理論認為，免疫力低下屬于中醫正氣不足的范疇，是由于正氣不足，身體各種功能下降，從而出現不能抵御外邪等一系列正虛的癥狀，其病機為正氣虛弱，多采用扶助正氣、固本培元法進行治療[6-7]。《本草綱目拾遺》中記載冬蟲夏草具有滋補強身、補精益氣之功效，西洋參具有生津止渴、補血養陰、健脾益氣之功效。本研究依照《保健食品檢驗與評價技術規范》[8]中有關增強免疫力功能的檢測方法，研究冬蟲夏草西洋參復合物是否具有增強免疫力的作用。

1 材料與方法

1.1 受試物

冬蟲夏草西洋參復合物購自北京海德潤制藥有限公司（批號20141210），性狀為黃白色至淺灰色粉末。保存條件：密閉置于常溫干燥處，保質期：24個月。

1.2 實驗動物

SPF級昆明小鼠，200只，雌性，3周齡，體重18～22 g，由武漢生物制品研究所提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（鄂）2012-0003。飼養條件：實驗動物飼養于湖北省食品藥品監督檢驗研究院，實驗動物使用許可證號：SYXK（鄂）2014-0009。光照為12 h明暗交替，溫度20～26℃，相對濕度40%～70%。

1.3 儀器與試劑

AB204-S電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；JM5102電子秤（余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司）；3K15臺式冷凍離心機（Sigma公司）；二氧化碳培養箱（SHEL-LAB公司）；ELX800酶標儀（BIOTEK公司）；BX53顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；AU400全自動生化儀（日本OLYMPUS公司）。RPMI 1640培養基、刀豆蛋白A（ConA）、CCK-8、Hank液、二硝基氟苯（DNFB）、綿羊紅細胞（SRBC）、印度墨汁、Na2CO3、雞紅細胞、YAC-1細胞、乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒。

1.4 方法

1.4.1 實驗分組及受試物給予方式 小鼠按體重隨機分為20組，每組10只。將20組小鼠分成5個實驗組，每個實驗組的40只動物分為4組（冬蟲夏草西洋參復合物高、中、低劑量組及陰性對照組）。第1實驗組：ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化實驗和NK細胞活性測定；第2實驗組：遲發型變態反應（DTH）實驗；第3實驗組：血清溶血素測定和抗體生成細胞檢測；第4實驗組：小鼠碳廓清實驗、胸腺和脾臟臟/體比值；第5實驗組：小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗。設冬蟲夏草西洋參復合物高、中、低劑量分別為0.9、0.6、0.3 g/kg，相當于人體推薦量的30、20、10倍劑量。臨用前用蒸餾水配制濃度為0.045、0.030、0.015 g/mL。各組小鼠灌胃體積為20 mL/kg。陰性對照組給予等體積蒸餾水。每天灌胃1次，連續30 d。

1.4.2 體重及淋巴器官臟器/體重比值測定 每周稱量所有動物體重，結束時處死小鼠。取出第4實驗組小鼠的胸腺和脾臟，稱重并計算臟/體比值。臟/體（%）=臟器重量/動物體重×100%。

1.4.3 ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化實驗（CCK-8法）及NK細胞活性測定（LDH測定法） 末次給予受試樣品后，處死小鼠，無菌操作下取脾，研磨制成單個脾細胞懸液后分成兩份（1號和2號），過200目篩網后Hank液洗2次，用RPMI 1640培養液調整細胞濃度至3×106個/mL（1號懸液）和2×107個/mL（2號懸液）。1號懸液用CCK-8法檢測經ConA誘導的小鼠淋巴細胞的增殖能力；以2號懸液為效應細胞，取對數生長期的YAC-1細胞，調整細胞終濃度至4×105個/mL作為靶細胞，依照LDH測定法進行檢測，全自動生化分析儀檢測LDH含量，計算NK細胞活性。

1.4.4 二硝基氟苯誘導的小鼠DTH實驗（耳腫脹法） 用1% DNFB致敏小鼠5 d后，再用1% DNFB刺激右耳，24 h后處死動物剪下左右耳殼。用打孔器取下直徑8 mm的耳片后分別稱重，以左右耳的重量之差來反映DTH的程度。

1.4.5 血清溶血素測定（血凝法）及抗體生成細胞檢測（Jerne改良玻片法） 將脫纖維處理后的羊血用生理鹽水洗滌3次，1500 r/min離心10 min。每只鼠經腹腔注射2%（V/V）SRBC 0.2 mL進行免疫。第5天按“血凝法”標準觀察血球凝集程度進行血清溶血素的測定，計算抗體水平。隨后處死小鼠，制備脾細胞懸液，調整細胞濃度為5×106個/mL。按“Jerne改良玻片法”標準進行檢測，計數溶血空斑數，以空斑數/106脾細胞表示抗體生成細胞數。

1.4.6 小鼠碳廓清實驗 末次給予受試物后，稱體重，從小鼠尾靜脈10 mL/kg注入稀釋4倍的印度墨汁，注入后2、10 min，分別從內眥靜脈叢取血20 μL，并立即加到2 mL 0.1% Na2CO3溶液中。以0.1% Na2CO3溶液作空白對照，酶標儀檢測600 nm波長處的OD值。將小鼠處死，取肝臟和脾臟，稱重，計算吞噬指數。

1.4.7 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗（滴片法） 每只小鼠腹腔注射2%（V/V）SRBC 0.2 mL。96 h后頸椎脫臼處死小鼠，按“滴片法”檢測，計算吞噬率和吞噬指數。

1.5 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析（One-way ANOVA，方差齊性采用Dunnett檢驗，方差不齊采用Dunnett T3檢驗）和非參數檢驗統計學處理。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 冬蟲夏草西洋參復合物對小鼠體重的影響

冬蟲夏草西洋參復合物各劑量組小鼠整個試驗過程中體重與陰性對照組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 冬蟲夏草西洋參復合物對小鼠淋巴器官臟器/體重比值的影響

冬蟲夏草西洋參復合物各劑量組小鼠胸腺/體重比值和脾臟/體重比值與陰性對照組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表2。

2.3 冬蟲夏草西洋參復合物對ConA誘導小鼠淋巴細胞轉化的影響

冬蟲夏草西洋參復合物各劑量組小鼠加ConA孔與不加ConA孔OD的差值，與陰性對照組比較差異無統計學意義（P > 0.05），說明其不能增強ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖能力，判定該實驗結果陰性。見表3。

2.4 冬蟲夏草西洋參復合物對DNFB誘導小鼠DTH反應的影響

冬蟲夏草西洋參復合物各劑量組均能促進小鼠對DNFB誘發的DTH反應，與陰性對照組比較差異有高度統計學意義（P < 0.01），判定該實驗結果陽性。見表4。

2.5 冬蟲夏草西洋參復合物對小鼠抗體生成細胞的影響

冬蟲夏草西洋參復合物各劑量組的溶血空斑數與陰性對照組比較，差異無統計學意義（P > 0.05），說明其不能增強抗體生成細胞能力，判定該實驗結果陰性。見表5。

2.6 冬蟲夏草西洋參復合物對小鼠血清溶血素抗體水平的影響

冬蟲夏草西洋參復合物各劑量組均能升高血清溶血素水平，與陰性對照組比較差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01），判定該實驗結果陽性。見表6。

2.7 冬蟲夏草西洋參復合物對小鼠碳廓清功能的影響

冬蟲夏草西洋參復合物中、低劑量組可提高小鼠碳廓清吞噬指數，與陰性對照組比較差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01），判定該實驗結果陽性。見表7。

2.8 冬蟲夏草西洋參復合物對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響

冬蟲夏草西洋參復合物各劑量組均不能提高吞噬率和吞噬指數，與陰性對照組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表8。

2.9 冬蟲夏草西洋參復合物對小鼠NK細胞活性的影響

冬蟲夏草西洋參復合物高、中劑量組能增強小鼠NK細胞活性，與陰性對照組比較差異有統計學意義（P < 0.05），判定該實驗結果陽性。見表9。

3 討論

免疫是機體對一切異物或抗原性物質進行非特異或特異性識別和排斥清除的一種生理學功能[9]，主要包括細胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細胞功能、NK細胞功能四大方面[10-11]。大量研究提示，冬蟲夏草能夠活化NK細胞[12]，T、B細胞[13-14]以及單核-巨噬細胞[15-16]等特異性或者非特異性淋巴細胞，從而起到對機體的免疫保護作用[17]。國內外學者也提示了西洋參多糖具有明顯的提高免疫力的作用[18-20]，為驗證兩者合用對機體是否具有免疫調節功能，本研究從細胞免疫、體液免疫、吞噬功能、NK細胞功能檢測冬蟲夏草西洋參復合物對小鼠免疫功能的影響，并觀察其對動物體重和免疫器官的影響，結果顯示：DNFB誘導小鼠DTH實驗中，冬蟲夏草西洋參復合物各劑量組左右耳片重量差值與陰性對照組比較有顯著性差異，可促進小鼠DTH；血清溶血素測定實驗中，冬蟲夏草西洋參復合物各劑量組抗體水平與陰性對照組比較差異有顯著性意義，可提高血清溶血素水平；碳廓清實驗中，冬蟲夏草西洋參復合物中、低劑量組吞噬指數與陰性對照組比較差異有顯著性意義，可提高小鼠巨噬細胞吞噬能力；NK細胞活性測定實驗中，冬蟲夏草西洋參復合物高、中劑量組LDH含量與陰性對照組比較差異有顯著性意義，可增強小鼠NK細胞活性。

機體的免疫作用主要通過激活巨噬細胞、促進T細胞轉化、提高B淋巴細胞和NK細胞的活性，同時激活網狀內皮系統和補體系統等來完成[20]。DTH是T細胞介導的一種超敏反應，用變應原（DNFB）刺激小鼠時T淋巴細胞會增殖成致敏淋巴細胞，部分還會分化成記憶細胞，當再次用同種變應原刺激時，記憶細胞會迅速增殖，發生以單核細胞浸潤為主的炎性反應，屬于細胞免疫應答功能；血清溶血素測定是B淋巴細胞產生抗SRBC抗體使致敏紅細胞溶解的溶血反應，屬于體液免疫應答功能；巨噬細胞可通過直接吞噬外來異物或自身衰老的細胞來發揮提高機體免疫力的作用，當墨汁被注入到小鼠尾靜脈血液中，血液中的外周血單核巨噬細胞會吞噬異物顆粒，可用巨噬細胞的吞噬指數反映其吞噬能力；活細胞的胞漿內含有LDH，NK細胞具有自然殺傷活性及抗腫瘤作用，當YAC-1細胞（小鼠淋巴瘤細胞）受到NK細胞殺傷后，LDH釋放到細胞外，因此通過檢測細胞上清液的LDH含量來反映NK細胞的活性。因此，本研究結果提示，冬蟲夏草西洋參復合物對小鼠細胞免疫功能、體液免疫功能、吞噬功能和NK細胞活性均有增強作用，促進了小鼠的特異性免疫和非特異性免疫。根據《保健食品功能學評價程序和檢驗方法》中增強免疫力實驗結果判定標準，認為冬蟲夏草西洋參復合物具有增強免疫力的作用。

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（收稿日期：2015-12-23 本文編輯：張瑜杰）