高效聚磷菌的分離鑒定及除磷性能分析

王圖錦,潘　瑾,劉雪蓮

(重慶交通大學(xué)河海學(xué)院,重慶　400074)

?

高效聚磷菌的分離鑒定及除磷性能分析

王圖錦,潘瑾,劉雪蓮

(重慶交通大學(xué)河海學(xué)院,重慶400074)

從連續(xù)穩(wěn)定運(yùn)行的AAO污水處理系統(tǒng)曝氣池污泥中分離篩選出4株聚磷菌(編號(hào)為P1,P2,P3,P4)進(jìn)行吸放磷實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明:4株聚磷菌具有較強(qiáng)的去除污水中磷酸鹽的能力,均表現(xiàn)出明顯的厭氧釋放磷、好氧吸收磷的特征,其中P1細(xì)菌的吸放磷特征最為顯著,對(duì)廢水磷的最大去除率可達(dá)到75.51%,P2、P3、P4對(duì)磷的最大去除率分別為8.77%、47.26%、30.19%。通過對(duì)4株細(xì)菌的16S rDNA 序列進(jìn)行測(cè)序分析,鑒定出P1、P2、P3、P4分別屬于微桿菌屬、芽孢桿菌屬、塚村氏菌屬、塚村氏菌屬細(xì)菌。

生物除磷;聚磷菌;廢水;生物學(xué)鑒定

強(qiáng)化生物除磷系統(tǒng)(enhanced biological phosphorous removal,EBPR)廣泛用于去除廢水中的磷酸鹽,采用不同結(jié)構(gòu)不同工藝的生物除磷污水處理廠大多依據(jù)經(jīng)驗(yàn)設(shè)計(jì)建造,缺乏對(duì)生物除磷微生物學(xué)機(jī)理的深入了解,導(dǎo)致許多污水處理廠設(shè)計(jì)及運(yùn)行參數(shù)并不符合生物除磷系統(tǒng)最佳條件,出現(xiàn)除磷效果差、污泥膨脹、剩余污泥過多、能耗高等諸多問題[1-4]。因此,加大對(duì)生物除磷系統(tǒng)中微生物特別是聚磷菌的研究顯得尤為重要,目前這方面也取得了顯著的進(jìn)展。聚磷菌(polyphosphate accumulating organisms,PAOs)具有從廢水中超量吸收磷酸鹽的能力,從而有效去除廢水中的磷酸鹽污染物,對(duì)污水處理系統(tǒng)生物除磷起著關(guān)鍵性作用,聚磷菌是生物除磷系統(tǒng)中主要的功能菌群之一。目前使用傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法以及非培養(yǎng)方法(如克隆文庫,FISH,DNA指紋圖譜等)對(duì)這類菌群進(jìn)行了較多研究。被認(rèn)為屬于PAOs類群的微生物有:產(chǎn)堿桿菌屬[5-6]、腸桿菌屬[7-8]、葡萄球菌屬[9]、變形菌屬[10]等,在不同的生物除磷系統(tǒng)工藝以及不同的污水成分下,PAOs類群可能由不同的種群組成。對(duì)生物除磷機(jī)理的深入了解還有待于進(jìn)一步分離聚磷菌,探討菌種去除污水中磷的機(jī)理。

本研究從一個(gè)實(shí)驗(yàn)室穩(wěn)定運(yùn)行的AAO反應(yīng)器曝氣池污泥中分離篩選出4株聚磷菌(P1、P2、P3、P4),并對(duì)菌株去除廢水中磷的性能進(jìn)行了初步探討,為深入了解生物除磷微生物學(xué)機(jī)理提供技術(shù)支持,同時(shí)為高效聚磷菌應(yīng)用于工程實(shí)際打下基礎(chǔ)。

1　試驗(yàn)方法

1.1聚磷菌的分離純化

將5 mL的活性污泥裝入滅菌離心管內(nèi),加入幾粒2～3 mm直徑的玻璃珠,在旋渦振蕩器上充分振蕩,使活性污泥均勻分散在水中,采用涂布法分離純化菌株。采用的培養(yǎng)基配方為:酵母膏：0.3 g;酪蛋白：1.2 g; CH3COONa·3 H2O：1.0 g;CaCl2·2 H2O：30 mg;KH2PO4：20 mg,MgSO4·7H2O：100 mg;NaCl：100 mg;pH：6.8～6.9;蒸餾水：1 000 mL;微量元素溶液0.6 mL。

微量元素配方(1L):H3BO3：0.15 g;FeCl3·6H2O： 1.5 g;KI：0.03 g;CuSO4·5 H2O：0.03 g;Na2MoO4·2 H2O：0.06 g;ZnSO4·7 H2O：0.12 g;MnCl2·4 H2O：0.12 g;CoCl2·2 H2O：0.15 g。

1.2聚磷菌的篩選與吸放磷實(shí)驗(yàn)

圖1　厭氧培養(yǎng)裝置

吸放磷實(shí)驗(yàn)中采用的模擬廢水配方如下:

蛋白胨0.1 g,酵母膏：0.01 g;CH3COONa·3 H2O：0.925 g; KH2PO4·3 H2O：65.51 mg;NaCl 0.05 g; MgSO4·7 H2O：153.7 mg;NaHCO3：0.075 g; CaCl2·2 H2O：33.1 mg。

1.3菌種的16S rDNA序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育樹分析

PCR簡(jiǎn)易DNA模板的制取:使用無菌牙簽從純菌落中挑取少許,置于30 μL的無菌水中混勻,使用98℃高溫加熱5 min,菌液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中,于10 000 r/min離心5 min,取上清液備用。

使用16S rDNA引物[11]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。正向引物為8F序列: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,反向引物為1495R序列:CTACGGCTACCTTGTTACGA。25 μL的PCR反應(yīng)體系為:簡(jiǎn)易DNA模板2 μL,10xbuffer(Mg2+)2.5 μL,10 mmol/L dNTP 0.5 μL,10 pmol/L引物各1 μL,2.5 U TaqDNA聚合酶。以無菌的TE緩沖液取代模板作空白對(duì)照。

PCR溫度設(shè)置:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min;56℃退火1 min,72℃延伸1 min 30s,共35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10 min結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物取5 μL作瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

PCR產(chǎn)物16S rDNA測(cè)序工作交由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成。將測(cè)得序列用Blast軟件提交GenBank,與GenBank中的已知序列進(jìn)行同源性分析,選取同源性較高的序列用Clustal x (1.8)軟件比對(duì),用MEGAversion 2中的Kimura2-Parameter Distance 模型計(jì)算進(jìn)化距離,用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2　結(jié)果與討論

2.1菌株吸放磷實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過涂布分離法獲得55株純菌株,對(duì)菌株作吸放磷試驗(yàn)得到具有較強(qiáng)除磷能力的4株細(xì)菌,其吸放廢水中磷能力測(cè)定結(jié)果如圖2所示。

圖2　菌株吸放磷能力測(cè)定結(jié)果

表1　菌株除磷效果

廢水的強(qiáng)化生物除磷理論[12-14]指出:在厭氧培養(yǎng)條件下,聚磷菌將胞內(nèi)存儲(chǔ)的多聚磷酸鹽分解,以正磷酸鹽的形式釋放到廢水中,同時(shí)利用廢水中的有機(jī)物用于合成聚β羥基丁酸(PHB)貯存能量。在好氧培養(yǎng)條件下,聚磷菌儲(chǔ)存的聚β羥基丁酸分解提供能量,用于聚磷菌從廢水中超量吸收磷酸鹽合成多聚磷酸鹽顆粒,在好氧培養(yǎng)階段聚磷菌吸磷量遠(yuǎn)高于厭氧釋磷量,從而廢水中的磷酸鹽污染物得以去除。本研究分離純化獲得的4株細(xì)菌具有典型的吸放磷特征,可以判定4株細(xì)菌屬于聚磷菌類群。

2.2菌株的16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果

4個(gè)菌株P(guān)1、P2、P3、P4的16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果

如圖3所示,結(jié)果表明PCR產(chǎn)物均單一明亮,大小約為1 500 bp。

M—1 Kb ladder DNA Marker;Nc—陰性對(duì)照?qǐng)D3　16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果

2.3菌株16S rDNA的序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育樹分析

將P1菌株的16S rDNA核酸序列在GenBank作BLAST比對(duì),結(jié)果表明該序列與Microbacteriumoxydans(DQ105974)最為接近,相似度達(dá)到99.9%。同時(shí)與Microbacteriumsaperdae(Y17236),Microbacteriumluteolum(Y17235),Microbacteriummaritypicum(AJ853910),Microbacteriumparaoxydans(AJ581908)相似度均達(dá)到99%以上。選擇同源性最高的10個(gè)16S rDNA全序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果如圖4所示。由圖4可見,P1菌株與Microbacteriummaritypicum(AJ853910)與Microbacteriumoxydans(DQ105974)嚴(yán)格聚為一族,根據(jù)同源性分析結(jié)果將P1菌株鑒定為微桿菌屬細(xì)菌。

P1菌16S rDNA測(cè)序結(jié)果如下:

GACGTCGTGATGTGCAGTCGAACGGTGACACGGAGCTTGCTCTGTGGGATCAGTGGCGAACGGG

TGAGTAACACGTGAGCAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCGCTGGAAACGGCGTCTAATACTGGAT

ATGTGACGTGACCGCATGGTCTGCGTCTGGAAAGAATTTCGGTTGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAG

CTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCAC

ACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCG

CAAGCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGGGACGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTAGCAGGG

AAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAAAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAA

TACGTAGGGCGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCTG

CTGTGAAATCCGGAGGCTCAACCTCCGGCCTGCAGTGGGTACGGGCAGACTAGAGTGCGGTAGGGG

AGATTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAG

ATCTCTGGGCCGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGGGTGGGGAGCAAACAGGCTTAGATACCCTGGT

AGTCCACCCCGTAAACGTTGGGAACTAGTTGTGGGGTCCATTCCACGGATTCCGTGACGCAGCTAAC

GCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCG

CACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATAC

GAGAACGGGCCAGAAATGGTCAACTCTTTGGACACTCGTAAACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGC

TCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTATGTTGCCAGCACGTA

ATGGTGGGAACTCATGGGATACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATC

ATGCCCCTTATGTCTTGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGCTGCAATACCGCGAGG

TGGAGCGAATCCCAAAAAGCCGGTCCCAGTTCGGATTGAGGTCTGCAACTCGACCTCATGAAGTCGG

AGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCG

TCAAGTCATGAAAGTCGGTAACACCTGAAGCCGGTGGCCTAACCCTTGTGGAGGGAGCCGCTAGATA

CGCCCCCA

圖4　根據(jù)P1菌株16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

此外，經(jīng)鑒定菌株P(guān)2屬于芽孢桿菌屬細(xì)菌，P3為塚村氏菌屬細(xì)菌，P4為塚村氏菌屬細(xì)菌。本實(shí)驗(yàn)獲得的4株細(xì)菌具有聚磷菌明顯的厭氧釋磷、好氧吸磷特征,在現(xiàn)有文獻(xiàn)中還未見報(bào)道這幾個(gè)屬的聚磷菌,本研究表明聚磷菌是一個(gè)寬泛的微生物類群,在不同地域、不同污水處理系統(tǒng)中存在不同的聚磷菌類群發(fā)揮除磷功能。

3　結(jié)　論

a. 本研究分離獲得的4株聚磷菌具有典型的厭氧釋磷、好氧吸磷特征,在厭氧培養(yǎng)條件下,4株聚磷菌向廢水中釋放磷,使得廢水中磷濃度略有升高,轉(zhuǎn)入好氧培養(yǎng)后,4株聚磷菌從廢水中超量吸收磷,廢水中磷濃度持續(xù)下降,約10 h后濃度趨于穩(wěn)定。

b. P1號(hào)聚磷菌除磷效果最為顯著,對(duì)廢水中磷的最大去除率可達(dá)到75.51%。P2、P3、P4號(hào)聚磷菌最大除磷率分別為8.77%、47.26%、30.19%。

c. 對(duì)4株聚磷菌作16S rDNA的測(cè)序分析,并將16S rDNA核酸序列在GenBank中作核酸序列鑒定出比對(duì),P1菌株為微桿菌屬的細(xì)菌,P2為芽孢桿菌屬細(xì)菌,P3為塚村氏菌屬細(xì)菌,P4為塚村氏菌屬細(xì)菌。

[ 1 ] 宋姬晨,王淑瑩,楊雄,等. 亞硝酸鹽對(duì)A2O 系統(tǒng)脫氮除磷的影響[J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué),2014,34(9):2231-2238.(SONG Jichen, WANG Shuying, YANG Xiong, et al. Effect of nitrite on nutrient removal in A2O system[J]. China Environmental Science, 2014,34(9): 2231-2238. (in Chinese))

[ 2 ] 白雪,張榮兵,顧劍,等. 大型污水處理廠污泥膨脹原因分析及其控制方法[J]. 中國(guó)給水排水, 2011, 27(23):31-35.(BAI Xue, ZHANG Rongbing, GU Jian, et al. Cause analysis and control of sludge bulking in large-scale WWTP[J]. China Water & Wastewater, 2011, 27(23):31-35. (in Chinese))

[ 3 ] SEVIOUR R J, MINO T, ONUKI M. The microbiology of biological phosphorus removal inactivated sludge systems[J]. FEMS Microbiology Reviews, 2003, 27(1): 99-127.

[ 4 ] 周可新,許木啟,曹宏. 生物除磷活性污泥系統(tǒng)微生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2005, 11(5):638-641.(ZHOU Kexin, XU Muqi, CAO Hong. Advance in microbiological research of activated sludge system for phosphorus removal[J]. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology, 2005,11(5): 638-641. (in Chinese))

[ 5 ] FLORES III A, NISOLA G M, CHO E, et al. Bioaugmented sulfur-oxidizing denitrification system withAlcaligenesdefragransB21 for high nitrate containing wastewater treatment[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering,2007,30(3): 197-205.

[ 6 ] ZHOU Yan, LIM M, HARJONO S,et al. Nitrous oxide emission by denitrifying phosphorus removal culture using polyhydroxyalkanoates as carbon source[J]. Journal of Environmental Sciences,2012,24 (9):1616-1623.

[ 7 ] 張培玉,孫夢(mèng),張晨.一株嗜鹽聚磷菌的篩選及除磷性能初探[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 31(11): 2368-2373.(ZHANG Peiyu,SUN Meng,ZHANG Chen. Preliminary study on screening and phosphorus removal characteristics of a halophilic phosphate accumulating bacterial strain[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2011, 31(11): 2368-2373. (in Chinese))

[ 8 ] NAKAMURA K, HIRAISHI A, YOSHIMI Y, et al.Microlunatusphosphovorusgen. nov., sp. Nov.:a new Gram-positive poly-phosphate accumulating bacterium isolated from activated sludge[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 1995, 45(1):17-22.

[ 9 ] 南亞萍,袁林江,王洋. 金黃色葡萄球菌聚磷特性研究[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2013,33(4):1028-1034.(NAN Yaping,YUAN Linjiang,WANG Yang. Characteristic and performance of phosphate accumulation byStaphyloccocusaureus[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2013, 33(4): 1028-1034. (in Chinese))

[10] NGUYEN H T T, NIELSEN J L, NIELSEN P H.‘CandidatusHalomonas phosphatis’, a novel polyphosphate accumulating organism in full-scale enhanced biological phosphorus removal plants[J]. Environmental Microbiology, 2012, 14(10): 2826-2837.

[11] AMANN R I, LUDWIG W, SCHLEIFER K H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation[J].Microbiological and Molecular Biology Reviews, 1995, 59(1):143-169.

[12] 鄭金偉,冉煒,鐘增濤,等. 增強(qiáng)型生物除磷過程中聚磷酸鹽積累微生物的研究進(jìn)展[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2004, 15(8):1487-1490.(ZHENG Jinwei, RAN Wei, ZHONG Zengtao, et al. Research advance in polyphosphate-accumulating microorganisms in enhanced biological phosphorus removal process[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2004, 15(8): 1487-1490. (in Chinese))

[13] WANG Yayi, REN Zhongjia, JIANG Fan, et al. Effect of copper ion on the anaerobic and aerobic metabolism of phosphorus-accumulating organisms linked to intracellular storage compounds[J]. Journal of Hazardous Materials, 2011, 186(1):313-319.

[14] AL-NAJJARA M M, COATSB E R, LOGE F J. The role of the microbial stringent response in excess intracellular accumulation of phosphorous in mixed consortia fed synthetic wastewater[J]. Water Research, 2011, 45(16):5038-5046.

Study on screening of phosphate-accumulating organisms and analysis of phosphorus removal characteristics

WANG Tujin, PAN Jin, LIU Xuelian

(SchoolofRiverandOceanEngineering,ChongqingJiaotongUniversity,Chongqing400074,China)

Four phosphate-accumulating bacterial strains, designated as P1, P2, P3, and P4, were separated from biological sludge in a stably operated AAO system for phosphorus absorption and release experiments. The results show that the four strains had high capabilities of removing phosphate from the waste water, and they exhibited high levels of phosphorus release in the anaerobic stage and phosphorus absorption in the oxic stage. P1 had the most significant phosphorus absorption and release characteristics. The maximum phosphorus removal rates of P1, P2, P3, and P4 were 75.51%, 8.77%, 47.26%, and 30.19%, respectively. Through sequence analysis of 16S rDNA, it was determined that P1 and P2 belonged toMicrobacteriumandBacillus, respectively, and both P3 and P4 belonged toTsukamurella.

biological phosphorus removal; phosphate-accumulating organisms; wastewater; biological identification

10.3880/j.issn.1004-6933.2016.05.013

重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃項(xiàng)目(cstc2014jcyjA20011)

王圖錦(1981—),男,講師,博士,主要從事環(huán)境微生物方面的研究。E-mail:wangtujin@163.com

X172

A

1004-6933(2016)05-0063-04

2015-12-29編輯：徐娟)