miR-135b在宮頸癌中的表達及臨床意義

劉　平

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miR-135b在宮頸癌中的表達及臨床意義

劉平

目的探討miR-135b在宮頸癌及相應癌旁組織中的表達情況及其與宮頸癌臨床病理特征的相關性。方法收集26例宮頸癌和相應癌旁組織，運用RT-PCR的方法檢測26例宮頸癌及相應癌旁組織中miR-135b的表達，分析miR-135b與宮頸癌臨床病理特征的相關性，并評價其臨床意義。結果熒光定量PCR顯示宮頸癌中miR-135b的表達(8.36±3.67)比癌旁組織(6.19±2.81)明顯上調(P<0.05)。miR-135b的表達與宮頸癌淋巴結轉移、臨床分期(Ⅲb)之間存在相關性(均P<0.05)。結論miR-135b可能在宮頸癌的發生發展中發揮重要的作用。

宮頸癌；miR-135b；臨床分期；淋巴結轉移

宮頸癌是全世界排名第二的女性惡性腫瘤，也是癌癥死亡的主要原因之一。雖然早期宮頸癌可以通過根治手術輔以化療或放療得以治愈，但很多因素影響宮頸癌的預后，包括腫瘤大小、基質浸潤深度、血管浸潤、子宮旁組織的入侵、盆腔淋巴結轉移等，其中盆腔淋巴結轉移被認為是影響宮頸癌預后最重要的危險因素[1]。近年的研究表明miRNA與宮頸癌的發生發展有密切的關系，其參與調控宮頸癌的進程和雌孕激素的表達[2]。研究發現miR-135b在骨肉瘤[3]、結腸癌[4]、前列腺癌[8]等多種腫瘤中表達上升。本研究用RT-PCR的方法檢測miR-135b在宮頸癌及其相應癌旁組織中的表達，并探討其與宮頸癌臨床病理特征的相關性，現報道如下。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1樣本和臨床資料的收集樣本來自2013年7月至2015年12月在南陽市第二人民醫院婦科26例宮頸鱗狀細胞癌行根治性子宮切除術和盆腔淋巴結清掃的樣本和臨床資料，年齡28～66歲。根據國際婦產科聯合會(Federation International of Gynecology and Obstetrics,FIGO)診斷標準，26例中有15例<Ⅲb，11例≥Ⅲb；8例有淋巴結轉移，18例無淋巴結轉移；7例低-中分化，19例中-高分化。所有患者術前均未接受化療或放療，并均有組織病理學確診。所有宮頸癌及癌旁組織標本收集后立即儲存至-80 ℃冰箱。

1.1.2試劑與儀器RNA提取試劑盒(天根生物公司)，miRNA逆轉錄試劑盒(諾維贊生物公司)，熒光定量PCR試劑盒康(世紀生物公司)，Biotek Epoch微量核酸定量儀購自美國Biotek公司，7500熒光定量PCR儀購自ABI 公司。

1.1.3RT-PCR引物設計miRNA-135b的引物序列通過PCR引物設計軟件Primer Premier 5.0設計has-mir-135b和U6的引物序列，具體序列如下：has-mir-135b-5p：5′-CCTGGCTTTTCATTCCTATGTGA-3′，U6：5′-GCTTCGGC AGCACATATACTAAA-3′，并由In-vitrogen 公司合成。引物干粉離心后用DEPC水配制成20 μmol·L-1，置于-20 ℃冰箱備用。

1.2方法

1.2.1總RNA的提取和反轉錄從宮頸癌組織和癌旁組織中抽提總RNA，按RNA提取試劑盒說明書進行，采用定量分光光度法在A260/280處對提取RNA進行定量。按miRNA逆轉錄試劑盒說明書對樣本總RNA進行反轉錄，反轉錄反應由1 μg的總RNA，與10 μL 2×RT mix，2 μL mix，1 μL oligo dNTPs,1 μL Random hexamers，總體系20 μL。 25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，經逆轉錄形成cDNA。

1.2.2RT-PCR檢測miR-135b根據RT-PCR試劑盒說明書進行熒光定量PCR，以2-ΔΔCt表示基因的相對表達水平。實時PCR體系為 20 μL。10 μL 2×mix，2 μL primer，2 μL reverse primer，2 μL cDNA，4 μL H2O。 95 ℃的30 s，95 ℃ 5 s和60 ℃ 30 s，總共40個循環。PCR是一式三份。

2　結果

2.1宮頸癌及癌旁組織miR-135b表達應用RT-PCR檢測26對配對的宮頸癌癌組織及癌旁組織中miR-135b的表達，通過配對樣本t檢驗，宮頸癌癌組織中miR-135b的平均表達量(8.36±3.67)大于癌旁組織中miR-135b的平均表達量(6.19±2.81)，差異具有統計學意義(t=2.247，P=0.003)，見圖1。

圖1　miR-135b實時熒光定量PCR (t=2.247，P=0.003)

2.2miR-135b表達與臨床病理特征腫瘤組織中miR-135b的表達水平與臨床分期(P=0.029)和有無淋巴結轉移(P=0.022)有相關性，即臨床分期越差，有淋巴結轉移時miR-135b表達水平越高，見表1。

表1　miR-135b表達與宮頸癌

3　討論

宮頸癌在低收入和中等收入國家是女性最常見的癌癥之一。在過去的一個世紀這些國家都在致力建立成功的篩查項目來顯著降低宮頸癌的發病率和死亡率。這些篩查依賴細胞學巴氏涂片發現宮頸癌的前期病變。這些檢查可以預防多達91%的浸潤性宮頸癌[5]。然而，這些項目需要大量資金投入。因此，尋找更為客觀精準的腫瘤標志物來標記宮頸癌發病和預后是重要的研究方向。miRNA可以結合到目標mRNA的3′UTR，調節mRNA的穩定和翻譯，最終導致翻譯抑制或目標mRNA被降解[6]。miRNA可分為致癌基因或抑癌基因，并參與細胞的多個生物過程，包括細胞增殖、凋亡、代謝、細胞分化[7]。miRNA的發現為腫瘤的研究提供了一個新的方向，也為探索宮頸癌新的生物標志物和其轉移和發展機制提供了方向。miRNA參與多種癌癥的轉移和發展。到目前為止，除了mir-127[8]，很少有miRNAs被報道與宮頸癌的轉移和進展有關。

miR-135b基因位于第l號染色體長臂第3區2號帶的第1號亞帶(1q32.1)，其在骨肉瘤[3]、結腸癌[4]、前列腺癌[8]等多種腫瘤中表達上升。在非小細胞肺癌中，miR-135b通過激活Hippo信號通路調控靶基因LZTS1，進而促進肺癌轉移[9]。Arigoni等[10]發現在乳腺癌和前列腺癌細胞中miR-135b表達上調，并靶向雌激素受體、雄激素受體和缺氧誘導因子1α( hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α) ，進而促進腫瘤細胞的增殖。在小鼠頭頸鱗癌細胞中，miR-135b促進腫瘤細胞的增殖、轉移、克隆，并下調FIH的表達和HIF通路的活性，成為致癌miRNA[11]。

Valeri等[12]發現，miR-135b的過度表達觸發了老鼠和人體抑癌基因APC的缺失，導致PTEN/PI3K通路的異常，癌基因SRC的表達上調并促進腫瘤的轉化和進展。miR-135b的過度表達在與結直腸癌相關的炎癥中是普遍事件，且與腫瘤分期及預后不良有密切關系。有研究認為糞便中的miR-135b，可作為結直腸癌及進展期腺瘤的非侵襲性的生物學標記物[13]。本研究采用熒光定量PCR實驗對26例子宮內膜癌癌組織及癌旁組織進行定量分析，發現miR-135b在宮頸癌癌組織中的表達(8.36±3.67)高于癌旁組織(6.19±2.81)，差異具有統計學意義，表明miR-135b可能在宮頸癌的發生發展中起一定作用。而且，miR-135b的表達與宮頸癌淋巴結轉移、臨床分期之間存在顯著的相關性(均P<0.05)。

總之，本研究表明miR-135b在宮頸癌癌組織中高表達，可能發揮著癌基因的作用，促進宮頸癌的增殖作用。并且miR-135b的表達與宮頸癌淋巴結轉移、臨床分期存在相關性。當然，由于樣本量和樣本來源的局限性，本研究結果有待于大樣本研究進一步證實。

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Expression and Its Clinical Significance of miR-135b in Cervical Cancer

LIU Ping

(Second People′s Hospital of Nanyang,Nanyang 473000,China)

ObjectiveTo explore the expression of miR-135b in cervical cancer and adjacent tissues and its correlation with clinicopathologic characteristics of cervical cancer.Methods26 fresh cervical cancer tissues and its paired adjacent tissues were collected and detected by RT-PCR for expressions of miR-135b and its correlation with cervical cancer.ResultsThe expression of miR-135b was significantly up-regulated in cervical cancer tissues compared with the adjacent tissues ((8.36±3.67) VS (6.19±2.81),P<0.05).The significant correlation were found between miR-135b expression and clinicopathologic parameters,including lymph node metastasis and clinical stage (Ⅲb) of cervical cancer (all P<0.05).ConclusionThe miR-135b might play an important role in the carcinogenesis and development of cervical cancer.

cervical cancer；miR-135b；clinical stage；lymphnode metastasis

1672-688X(2016)03-0177-03DOI：10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.03.005

2016-06-15

南陽市第二人民醫院，河南南陽 473000

劉平(1984-)，女，河南南陽人，醫師，從事婦產科臨床、科研工作。

R737.33,Q786

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