STAT3、Nanog基因在食管癌組織中的表達及臨床病理特征相關性

陸　曉，馮笑山，高社干，周福有，王能超，楊海軍

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STAT3、Nanog基因在食管癌組織中的表達及臨床病理特征相關性

陸曉1，馮笑山1，高社干1，周福有2，王能超2，楊海軍2

目的探索STAT3、Nanog基因在食管癌組織中的表達及其相關性，為食管癌基因治療尋找新的靶點。方法選取2014年河南科技大學第四附屬醫(yī)院安陽市腫瘤醫(yī)院食管癌50例為研究對象。運用RT-PCR技術檢測食管癌癌組織與癌旁組織中STAT3、Nanog mRNA的表達；同時聯(lián)合運用Western blot 技術與免疫組化技術檢測STAT3、Nanog蛋白在食管癌及癌旁組織的定位與表達。結(jié)果食管癌組織中STAT3、Nanog的mRNA和蛋白表達明顯高于癌旁組織(P<0.05)；STAT3和Nanog在低分化食管癌組織中的表達明顯高于其他分化程度(P<0.05)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌組織中STAT3、Nanog的陽性表達率低于伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的(P<0.05)，無遠處轉(zhuǎn)移的食管癌組織中的STAT3、Nanog陽性率明顯低于伴遠處轉(zhuǎn)移的食管癌組織(P<0.05)。食管癌組織中STAT3和Nanog的表達呈正相關(r=0.303，P<0.05)。結(jié)論STAT3、Nanog基因可能在食管癌發(fā)生、發(fā)展機制中發(fā)揮重要作用，其可能成為食管癌基因診斷和治療的新靶點。

食管癌；STAT3；Nanog；RT-PCR；Western blot；免疫組化

食管癌是嚴重威脅人類生命的常見惡性腫瘤之一，其致死率為世界第6位[1]。尋找和確定食管癌發(fā)展過程中起關鍵作用的基因、蛋白等關鍵環(huán)節(jié)，有助于對食管癌的發(fā)病機制進一步認識，并將其應用于腫瘤的預防、早期診斷與治療。研究發(fā)現(xiàn)Nanog基因在囊胚內(nèi)細胞群、原始生殖細胞以及胚胎干細胞(embryonic stem cell,ESCs)中高表達，維持細胞多能性和自我更新，致使其獲得增殖及永生能力的分子基礎[2-3]。而STAT3是JAK-STAT信號通路家族的重要成員，它既是核轉(zhuǎn)錄因子，也是一種信號轉(zhuǎn)導因子，其參與調(diào)控細胞的生長、分化、凋亡、免疫反應、惡性轉(zhuǎn)化、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移和免疫逃避等[4]。有報道稱Nanog可能是STAT3途徑的一個直接靶基因，它們可能具有協(xié)同或交互作用[5-6]。本文現(xiàn)采用免疫組化SP法(streptavidin peroxidase conjugated method,SP)、Western blot和RT-PCR技術檢測食管癌及癌旁組織中STAT3和Nanog的表達，探討二者在食管癌發(fā)生、進展中的作用及其與食管癌臨床病理之間的相互關系。

1　材料與方法

1.1標本來源選取2014年河南科技大學第四附屬醫(yī)院安陽市腫瘤醫(yī)院食管癌切除標本50例，年齡(61.50±15.30)歲。高分化鱗癌14例，中分化鱗癌17例，低分化鱗癌19例。根據(jù)TNM分期標準判斷，腫瘤浸潤深度：T1 16例、T2 12例、T3 14 例、T4 8例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例；伴有遠處轉(zhuǎn)移24例。癌旁組織為食管癌手術切除標本中距癌組織邊緣3～5 cm的食管組織。選取同時期10例STAT3和Nanog陽性表達的睪丸精原細胞瘤作免疫組化的陽性對照。

1.2免疫組織化學分析

1.2.1主要試劑兔抗人Nanog多克隆抗體(濃度1∶1 000)、兔抗人STAT3單克隆抗體(1∶1 000)均購自武漢三鷹公司；SP試劑盒和DAB 酶底物顯色試劑盒均購自北京中杉金橋公司。

1.2.2方法免疫組化染色采用SP法嚴格按試劑說明操作。

1.2.3結(jié)果判斷Nanog和STAT3表達于細胞質(zhì)和(或)胞膜，按染色強度和陽性細胞數(shù)所占腫瘤細胞總數(shù)的百分比計分。染色強度：細胞未染色為0 分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色3分；陽性細胞數(shù)≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；將兩項得分結(jié)果相乘：0～7分為陰性，≥8分為陽性。兩位高年資病理醫(yī)師雙盲讀片。

1.3Western blotting實驗

1.3.1主要試劑兔抗人Nanog多克隆抗體(濃度1∶1 000)、兔抗人STAT3單克隆抗體(1∶1 000)均購自武漢三鷹公司，預染Marker。凝膠成像系統(tǒng)、電泳槽、電泳儀均購自BIO-RAD公司(美國)。

1.3.2方法

1.3.2.1SDS-PAGE電泳①配制12%分離膠和5%的濃縮膠，制備SDS-PAGE緩沖液；②將備用變性的組織蛋白上樣；③電泳：濃縮膠80 V，30 min；分離膠120 V，90 min。總時間約為120 min。

1.3.2.2轉(zhuǎn)膜按從陽極到陰極的順序依次放置：海綿、3 M濾紙、PVDF膜、凝膠、3 M濾紙、海綿；加入轉(zhuǎn)膜液，低溫、恒壓90 V，l.5 h；用含5%脫脂牛奶的封閉緩沖液室溫下封閉1 h。

1.3.2.3免疫反應嚴格按試劑盒說明操作。

1.3.2.4化學顯影和定影①在暗室中，將ECL化學發(fā)光試劑盒中試劑A和試劑B在保鮮膜上等體積混合，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸l min，然后將PVDF膜移至另一保鮮膜上，移去殘液，包好。②放入凝膠成像系統(tǒng)機中曝光，以tublin作為內(nèi)參照，進行凝膠圖像分析，應用灰度分析軟件(ImageJ軟件)對Nanog和STAT3條帶進行灰度值的比值對比分析。

1.4RT-PCR

1.4.1主要試劑Nanog引物、STAT3引物、GAPDH引物、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒均購自生工生物工程技術有限公司(上海)。PCR擴增儀購自百泰克生物技術有限公司(北京)。

1.4.2方法Trizol法提食管組織總RNA，取<1 pg的RNA用M-M LV酶逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以所得cDNA為模板進行PCR反應。通過primer5軟件進行引物設計。Nanog的上游引物：5’-AATAACCTTGGCTGCCGTCTC-3’，下游引物：5’-AGCCTCCCAATCCCAAACAAT-3’。STAT3上游引物：5’-ACACCGTAAGTGGCTTCCTT-3’，下游引物：5’-CTCTCACCCAGTGTCCCATTC-3’。GAPDH的上游引物：5’-GCCACATCGCTCAGACACC-3’，下游引物：5’-GATGGCAACAATATCCACTTTACC-3’。建立20 μL PCR 反應體系：2xSuperReal PreMix Plusc DNA10 μL、cDNA 2 μL、Nanog(或STAT3)正反引物各0.5 μL(或GAPDH正反引物0.5 μL)，95 ℃預變性15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸32 s，共進行40個循環(huán)。用GAPDH mRNA為內(nèi)參進行對照校正，各樣本的Nanog(或STAT3)基因擴增量與GAPDH基因擴增量采用Y=2-ΔΔCt法計算mRNA水平Nanog和STAT3的相對表達量。

2　結(jié)果

2.1食管癌中Nanog和STAT3的表達食管癌癌組織及癌旁組織中 Nanog和STAT3在細胞核及細胞質(zhì)中均有表達，見圖1。Nanog、STAT3在食管癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。因睪丸精原細胞瘤生物學特性與干細胞特性類似，將睪丸精原細胞瘤中的基因表達免疫組化結(jié)果作為陽性對照。

A.食管癌組織中Nanog的表達　B.癌旁組織中Nanog的表達　C.精原細胞瘤中Nanog的表達　D.食管癌組織中STAT3的表達　E.癌旁組織中STAT3的表達　F.精原細胞瘤中STAT3的表達圖1　Nanog、STAT3的表達

2.2Western blotting實驗結(jié)果凝膠成像以48 kDa的tublin為內(nèi)參，應用灰度分析軟件(ImageJ軟件)對目的蛋白條帶的灰度值的比值進行分析。結(jié)果顯示目的蛋白Nanog、STAT3在食管癌組織中高表達，癌旁組織中低表達，與免疫組化結(jié)果相一致，見圖2。

T.癌組織　N.癌旁組織圖2　Nanog、STAT3蛋白表達凝膠成像對比

2.3RT-PCR結(jié)果癌組織中的Nanog和STAT3擴增量大于癌旁組織中的擴增量，說明Nanog與STAT3在食管癌癌組織中比其癌旁組織中的表達量高，見圖3。

A.Nanog mRNA擴增　B.STAT3 mRNA擴增圖3　Nanog、STAT3組織中的mRNA擴增情況

2.4Nanog與STAT3與食管癌臨床病理特征Nanog與STAT3在低分化食管癌組中的表達明顯高于高+中分化癌組(P<0.05)；無遠處轉(zhuǎn)移的食管癌組織中二者陽性率明顯低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及伴遠處轉(zhuǎn)移的食管癌組織(P<0.05)，見表2。食管癌組織中Nanog和STAT3的表達呈正相關(rs=0.303，P<0.05)。

表2　Nanog和STAT3與食管癌臨床特征　例(%)

3　討論

Nanog為ESCs中表達的轉(zhuǎn)錄因子，是ESCs自我更新和多潛能性的重要調(diào)控因子[7]，在胚胎外胚層維持多能性方面發(fā)揮的作用較為關鍵[8]。ESCs的多潛能性的維持可能與Nanog調(diào)控分化一些相關的轉(zhuǎn)錄因子如STAT3的活性有關[9]。到目前為止，研究者對Nanog、STAT3在胚胎癌細胞和生殖細胞腫瘤中的作用所做的科研工作較多[10]，發(fā)現(xiàn)兩者在睪丸癌、胚胎性腫瘤和精原細胞瘤組織中表達量較高[11]。而且除了生殖類腫瘤外，Nanog、STAT3在體細胞實體腫瘤方面發(fā)揮的作用也逐漸受到關注，在乳腺癌、腦部腫瘤、骨肉瘤和膀胱癌腫瘤組織中存在與干細胞特性類似的細胞團，在這些細胞團中也發(fā)現(xiàn)Nanog、STAT3表達量較高[12]。本實驗結(jié)果提示在食管癌組織中Nanog、STAT3的表達量高于癌旁組織，這一結(jié)果表明食管癌組織中可能含有高表達Nanog、STAT3的腫瘤干細胞，在食管癌的發(fā)生階段發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果顯示低分化癌組織中Nanog、STAT3的陽性率明顯高于中高分化的癌組織中，表明食管癌的發(fā)展、分化過程中有Nanog、STAT3的參與，與 Siu報道結(jié)果相似[13]。而Nanog、STAT3可能位于干細胞維持全能性及自我更新調(diào)控網(wǎng)絡的頂端，協(xié)同作用來調(diào)控與干細胞自我更新及分化方面有關的基因[14]。干細胞的分化狀態(tài)與Nanog、STAT3的表達水平密切相關[15]，在維持干細胞的低分化狀態(tài)、維持自我更新潛能及保持全能性方面與Nanog、STAT3的作用也是分不開的。而本研究中食管癌組織中Nanog和STAT3的表達明顯高于癌旁組織，并且在低分化食管癌組織中的表達明顯高于高、中分化程度的食管癌。Nanog和STAT3的表達與臨床病理特征的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、有無遠處轉(zhuǎn)移與否有關。并且，食管癌癌組織中Nanog和STAT3的表達呈相關性，研究結(jié)果表明食管癌發(fā)生與可能與腫瘤干細胞 Nanog和STAT3的表達呈相關，有望同前列腺癌中STAT3的作用一樣作為食管癌診斷的分子標志。

總之，本研究結(jié)果提示STAT3、Nanog基因可能在食管癌發(fā)生、發(fā)展機制中發(fā)揮重要作用，可能成為食管癌基因診斷和治療的新靶點。

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Expression of STAT3 and Nanog Gene in Esophageal Cancer and Its Correlation with the Clinicopathological Characteristics

LU Xiao1,FENG Xiao-shan1,GAO She-gan1,ZHOU Fu-you2,WANG Neng-chao2,YANG Hai-jun2

(1.First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China;2.Anyang Tumor Hospital,Anyang 455000,China)

ObjectiveTo explore STAT3 and Nanog gene expression in esophageal cancer tissues and its correlation with the clinicopathological characteristic in order to look for new targets of gene therapy for esophageal cancer.MethodsThere were 50 cases of esophageal cancer which was selected from the Fourth Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology in 2014 as the research object.The expression of STAT3 and Nanog mRNA was detected by RT-PCR in esophageal carcinoma and paracancerous tissues.Meanwhile the expression and localization of STAT3 and Nanog protein were detected by Western blot technique and immunohistochemical technique in same tissues.ResultsThe mRNA and protein expression of STAT3 and Nanog in esophageal cancer tissues was significantly higher than that in paracancerous tissue(P<0.05).The expression of STAT3 and Nanog in poorly differentiated esophageal cancer tissues was observably higher than that in other differentiated cancer tissues(P<0.05).Among esophageal cancer tissues，without lymph node metastasis cancer tissues were accompanied with significantly lower positive expression rates than the tissues with lymph node metastasis(P<0.05).The esophageal cancer tissues without distant metastasis have less expression of STAT3 and Nanog than the tissues with distant metastasis(P<0.05).The expression of STAT3 and Nanog in Esophageal cancer tissues showed positive correlation(r=0.303,P<0.05).ConclusionSTAT3 and Nanog gene may play an important role in carcinogenesis and development of esophageal cancer,and it might be the new target genes for diagnosis and treatment of esophageal cancer.

esophagus cancer；STAT3；Nanog；RT-PCR；Western blot； immunohistochemisty

1672-688X(2016)03-0170-04DOI：10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.03.003

2016-01-26

1.河南科技大學第一附屬醫(yī)院，河南洛陽 471003

2.安陽市腫瘤醫(yī)院，河南安陽 455000

陸曉(1986-)，男，山東肥城人，醫(yī)師，從事腫瘤科臨床工作。

馮笑山，男，博士，教授，E-mail：samfeng137@hotmail.com

R735.1

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