降解菌DNEH-S1的室內模擬試驗

張 奇

（東北農業大學，哈爾濱 150036）

降解菌DNEH-S1的室內模擬試驗

張 奇

（東北農業大學，哈爾濱 150036）

農業生產中廣泛使用的農藥、地膜、化肥等農用化學品，造成多種有機物對土壤的復合污染。當有害物質過多，超過土壤的自凈能力，就會引起土壤的組成、結構和功能發生變化，微生物活動受到抑制，有害物質或其分解產物在土壤中逐漸積累，并間接危害人體健康。鄰苯二甲酸酯（PAEs）是一類環境內分泌物質，作為農用塑料地膜中的增塑劑被大量使用，易從塑料地膜中釋放而造成土壤污染。我國農田土壤普遍存在農藥、PAEs等有機物復合污染，生物降解是削減土壤中有機污染物的重要途徑。試驗研究了降解菌DNEH-S1在土壤中對DEHP降解特性及土壤中養分的動態變化，探討了典型有機物復合污染土壤生物降解技術的可行性。

鄰苯二甲酸酯；生物降解；土壤修復；模擬試驗

1　前言

DEHP是人工合成的化學物質，其的中文名為鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯，廣泛應用于塑料制品中，包括農用薄膜和塑料大棚膜。我國每年地膜使用量近百萬噸，地膜覆蓋面積達1000多萬公頃，覆蓋作物達40多種［1］。聚乙烯類地膜以其質輕、透光、保溫保濕性好，在我國被廣泛應用于冬季暖棚蔬菜生產及早稻、西瓜、棉花等地覆膜育秧，但隨著地膜老化、破碎和回收不凈，造成地膜在田間的殘留量不斷增加［2］。大量殘留地膜不但對農田耕作、植物生長等造成影響，其深層次的影響還在于地膜中的增塑劑（鄰苯二甲酸酯類化合物（PAEs），又稱酞酸酯）的污染。

當大量PAES進入土壤環境中，土壤微生物群落的數量、結構和多樣性都會受到影響，最終使土壤生態系統的功能受到損害［2-5］。PAEs在植物體中有較強的富集作用，甚至在它們的深加工產品中都發現了PAEs的存在［6］。DEHP濃度增加，葉綠素含量逐漸下降，DEHP10mg/kg時，豇豆葉綠素a含量比空白下降8.6%，葉綠素b含量比空白下降13.3%；DEHP50mg/kg時，豇豆葉綠素a含量下降23.5%，葉綠素b含量下降26.7%［7］。

人類通過皮膚、呼吸、食物鏈等途徑長期接觸環境雌激素PAEs，可能導致人肢體畸形、內分泌失調、生殖系統病變，精子數量減少，乳腺癌發病率升高等不良后果，而且可以通過胎盤和授乳產生跨代影響［8］?？傊?，鄰苯二甲酸酯類對人類和其他生物都存在潛在危害。

DEHP是我國優先控制的PAEs類污染物之一，在環境中難以自發降解，在土壤中的殘留量大，威脅生態安全。因而找到可行性高、效果好的方法控制和降低DEHP在環境中的含量和危害刻不容緩。由于常規處理方法難以對其有較好的處理，因此，利用微生物降解DEHP修復污染土壤是當前的研究熱點。

本研究在室內條件下將DEHP降解菌DNEH-S1施用于DEHP污染土壤中，探究了該降解菌在土壤中的實際修復效果及修復過程中土壤養分含量的變化。以期為DEHP污染土壤的生物修復提供依據。

2　材料與方法

2.1儀器與試劑

儀器：UV-2051PC紫外可見分光光度計；TPY-6土壤養分快速測試儀。

試劑：DEHP標準溶液（純度≥99%）；三氯甲烷（分析純）；乙醇（分析純）；N、P、K養分測試試劑。

2.2測定方法

2.2.1土壤中DEHP含量的測定

2.2.1.1土壤中DEHP的萃取

土壤經風干、研磨、過篩，用10 mL三氯甲烷超聲萃取二次，每次萃取時間10min。

2.2.1.2土壤中DEHP含量測定

（1）測定波長選擇：以三氯甲烷為空白，作掃描基線校正。并對DEHP和樣品檢測液在一定波長范圍內進行掃描，標準品及樣品均在某一波長處有最大吸收峰，即可確定為最佳吸收波長。

（2）標準曲線的繪制：準確移取DEHP 標準溶液，用三氯甲烷溶解并定容，分別配制成一定濃度的系列標準溶液。在最佳波長下，利用紫外分光光度計測定上述系列標準溶液，以吸光度對DEHP 質量濃度進行線性回歸，得出線性回歸方程及相關系數。

（3）回收率試驗：向無DEHP土壤中加入一定量的已知濃度的DEHP標準溶液，用三氯甲烷進行萃取。對萃取后溶液進行DEHP含量的測定，計算樣品回收率。

（4）樣品測定：分別取3份土樣，用三氯甲烷萃取，在最佳波長下用紫外分光光度計對萃取后溶液進行測定，得出其吸光度，利用標準曲線，計算DEHP的含量。

2.2.2土壤中速效養分含量的測定

土壤中N、P、K含量：依照TPY-6土壤養分快速測試儀說明書進行。

2.3試驗設置

供試土壤采自東北農業大學校內，分為處理組和對照組。在供試土壤中加入一定量的DEHP，使兩組土壤中DEHP含量達到50mg/kg，在處理土壤中接入一定量的DEHP降解菌DNEH-S1，對照組土壤中不接入菌。將兩組樣品置于25℃的培養箱中，為防止DEHP光解造成誤差，在三角燒瓶外裹錫紙，并且在修復試驗期間定期補無菌水。本試驗中的降解菌DNEH-S1來自于東北農業大學資環學院環境污染生物修復研究室，經16S的DNA鑒定為Pseudomonas aeruginosa。

3　試驗結果與分析

3.1土壤中DEHP的含量

3.1.1最佳吸收波長確定

以三氯甲烷為空白對DEHP和樣品檢測液在250～ 700nm波長范圍內進行掃描，樣品在275nm波長處有最大吸收峰，故選擇275nm為測定波長。

3.1.2DEHP標準曲線的繪制

準確移取DEHP標準溶液，用三氯甲烷溶解并定容，分別配制成30、50、70、90、100mg/L的標準系列溶液，用紫外分光光度計測定上述系列標準溶液在275nm波長處的吸光度。以吸光度對DEHP質量濃度進行線性回歸，得DEHP標準曲線圖及線性回歸方程，如圖1所示。相關系數R2 = 0.9911，表明該方法線性關系良好，測定數值比較準確。

圖1　DEHP的標準曲線

3.1.3回收率試驗

向100g土壤中，分別加入70mg/kg和100mg/kg的DEHP標準品，充分混勻后取10g樣品，用10mL三氯甲烷進行萃取，用“1.5”方法對萃取后溶液進行5次平行測定，試驗結果如下表所示。

由表可知，DEHP 的回收率為92.02%～102.93%，表明樣品的回收率可靠。

3.1.4降解菌修復效果研究

本試驗研究了6周內DNEH-S1菌株對污染土壤的修復效果，如圖2所示。對照組土壤中在整個修復過程中DEHP含量降低了3.09mg/kg，降解率為6%，這可能是因為土壤中原生微生物群落對DEHP有一定的降解效果。

處理組初始DEHP濃度為50mg/kg，6周之后處理組土壤中DEHP含量下降為10.56mg/kg，降解率高達79%，說明降解菌DNEH-S1在土壤中修復效果較好，可以進行進一步的應用研究。

DEHP加標回收試驗結果表

圖2　降解菌修復效果

本試驗研究了6周內處理組與對照組土壤內速效氮含量的變化，如圖3所示。對照組土壤中在整個修復過程中速效氮的含量變化較小，變化可能是因為土壤中原生微生物群落對土壤中的氮有一定的吸收效果。

處理組初始速效氮濃度為10.44mg/L，6周之后處理組土壤中速效氮含量下降為9.01mg/L，吸收率高達13.70%。

本試驗研究了6周內處理組與對照組土壤內速效磷含量的變化，如圖4所示。對照組土壤中在整個修復過程中速效磷的含量變化較小，變化可能是因為土壤中原生微生物群落對土壤中的磷有一定的吸收效果。

處理組初始速效磷濃度為9.51mg/L，6周之后處理組土壤中速效氮含量下降為7.80mg/L，吸收率高達17.98%。

本試驗研究了6周內處理組與對照組土壤內速效鉀含量的變化，如圖5所示。對照組土壤中在整個修復過程中速效鉀的含量變化較小，變化可能是因為土壤中原生微生物群落對土壤中的鉀有一定的吸收效果。

處理組初始速效鉀濃度為54.69mg/L，6周之后處理組土壤中速效鉀含量下降為39.63mg/L，吸收率高達27.54%。

圖3 修復期間土壤中N含量

圖4　修復期間土壤中P含量

3.2修復過程中土壤N、P、K含量變化

圖5　修復期間土壤中K含量

綜上所述，修復過程土壤中的N、P、K含量變化如圖3、圖4、圖5所示。在整個修復過程中，處理組土壤N、P、K含量均大幅降低，對照組土壤中N、P、K含量在整個試驗過程中基本保持不變，可見該降解菌在土壤中生長狀況良好，能適應該土壤的生活環境，具有持續開發的潛力，可進行進一步的研究與應用。

4　結論

鄰苯二甲酸酯（PAEs）作為農用塑料地膜中的增塑劑被大量使用，易從塑料地膜中釋放出而造成土壤污染。我國農田土壤普遍存在農藥、PAEs等有機物復合污染，經試驗驗證，生物降解是削減土壤中有機污染物的重要途徑。本試驗研究了降解菌DNEH-S1在土壤中對DEHP降解特性及土壤中速效養分的動態變化，探討了典型有機物復合污染土壤的生物降解的技術可行性。

綜合本試驗結果，得出以下結論：

初始DEHP濃度為50mg/kg，6周之后處理組土壤中DEHP含量下降為10.56mg/kg，降解率高達79%，由試驗結果可知，降解菌DNEH-S1對于土壤中DEHP污染有較好的修復效果。

在連續6周的營養物監測試驗中，速效N、P、K含量不斷降低，說明降解菌DNEH-S1在土壤中生長狀況良好，能適應該處土壤環境。具有持續開發的潛力，可以進行進一步的研究與應用。

［1］ 何文清，嚴昌榮，趙彩霞，等.我國地膜應用污染現狀及其防治途徑研究［J］.農業環境科學學報，2009，28（3）：533-538.

［2］ 滕應，黃昌勇.重金屬污染土壤的微生物生態效應及其修復研究進展［J］.土壤與環境，2002，11（1）：85-89.

［3］ 謝慧君，石義靜，滕少香，等.鄰苯二甲酸酯對土壤微生物群落多樣性的影響［J］.環境科學，2009，30（5）：1286-1291.

［4］ Liang，D W，Fang H H P，Zhang T. Microbial characterization and quantification of an anaerobic sludge degrading dimethyl phthalate.［J］.Journal of Applied Microbiology，2009，106（1）：296-305.

［5］ 苗靜，?；荩貊魏?，等. DOP與Pb單一及復合污染對土壤酶活性的影響［J］.環境科學研究，2009，22（7）：856-861.

［6］ 安瓊，靳偉.酞酸酯類增塑劑對土壤-作物系統的影響［J］.土壤學報，1999，36 （1）：118-126.

［7］ 王曙光，林先貴，尹睿.土壤中酞酸酯（PAEs）對叢枝菌根化植物生長的影響［J］.生態與農村環境學報， 2003，19（1）：31-35.

［8］ 王麗霞.保護地鄰苯二甲酸酯污染的研究［D］.山東農業大學，2007.

Indoor Simulation Examination of Degradation Bacteria DNEH - S1

ZHANG Qi
（Northeast Agricultural University， Harbin 150036， China）

Phthalic acid esters （PAEs） is a kind of environmental endocrine substances that is widely used as the plasticizer in the farming-use plastic film， easy to release from the plastic film and cause soil pollution. Farmland soils commonly show pesticides， PAEs and other organic compound pollution in China and biodegradation is an important approach to cut down organic pollutants in soil. This experiment studies the degradation bacteria DNEH - S1 in the soil of DEHP degradation charac-teristics and the dynamic changes of the nutrients in the soil， discussing the bio-degradation technology feasibility of typical organic compound contaminated soil.

DEHP； bio-degradation； soil remediation； simulated test

X53

A

1006-5377（2016）09-0052-04