微波誘變選育高效溶磷木霉菌株的研究

薛應鈺，葉　巍，張樹武，劉　佳，徐秉良

(甘肅農業大學植物保護學院， 甘肅 蘭州 730070)

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微波誘變選育高效溶磷木霉菌株的研究

薛應鈺，葉巍，張樹武，劉佳，徐秉良

(甘肅農業大學植物保護學院， 甘肅 蘭州 730070)

為了獲得高效溶磷菌株，對木霉菌T6菌株進行微波誘變處理，測定并分析了微波輸出功率和輻照時間等參數對誘變效果的影響。結果表明：最佳誘變條件是微波輸出功率900 W，輻照時間70 s，且在此條件下得到8株具有較高溶磷能力的突變菌株T6-9、T6-33、T6-93、T6-126、T6-157、T6-188、T6-196和T6-203。經過多代轉接培養最后得到一株遺傳穩定的溶磷木霉菌株T6-157，該菌株在液體培養條件下溶磷量為204.46 mg·L-1，與出發菌株相比，溶磷量提高了107.97%，植酸酶活性提高了57.35%，且突變菌株對土傳植物病原菌的拮抗能力也有所提高。

木霉菌；微波誘變；溶磷能力；拮抗作用

磷是限制植物生長的主要元素之一，對氮固定、光合作用、能量轉移、信號傳導、生物大分子合成和呼吸作用都有著重要的影響[1-2]。據報道，我國74%的耕地土壤缺磷[3]，一方面，土壤中常以磷酸三鈣存在的磷酸鹽溶解性差，很難被植物所吸收；另一方面，施入磷化肥的大部分磷素在土壤中由于與Fe2+和Al3+等的強烈吸附和固定作用而形成閉蓄態難溶性磷酸鹽，當季利用率在5%～25%[4-5]。溶磷微生物(PSMs)能通過分泌有機酸以及與鐵、鋁、鈣等離子結合，增加礦物態和吸附態磷素的溶解性，提高土壤中的可溶性磷含量，從而可以提高植物對磷的利用效率，使植物獲得較充足的磷營養[6-7]。目前已報道的具有溶磷能力的微生物包括細菌、真菌和放線菌等，其中篩選的溶磷細菌數量和種類較多，如熒光假單孢菌(Pseudomonasfluorescens)[8]和芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)[9]已投入生產應用，但是對真菌的研究較少。因此，挖掘和利用高效溶磷真菌種質資源是當前迫切需要解決的科學問題之一。

近年來，研究發現木霉菌(Trichodermasp.)除了作為重要的植物病害生物防治因子之外，還具有提高作物營養利用的能力[10]，如綠色木霉(T.viride)和哈茨木霉(T.harzianum)等具有溶解難溶性無機磷酸鹽和金屬礦物的能力[11-12]，而本課題組在前期研究中分離到一株具有溶磷和拮抗作用的木霉菌T6菌株，但在前期研究中發現該野生菌株溶磷能力相對較弱，采用菌種誘變育種的方法可以提高已有菌種的選育效率，彌補野生種溶磷能力弱的缺陷，篩選和提高木霉菌的溶磷能力正在受到人們的高度重視。

目前，改良微生物菌株的手段主要有誘變育種、原生質體融合和遺傳改造等[13]，其中微波誘變是一種利用低能高頻電磁波刺激水、蛋白質、核苷酸、脂肪和碳水化合物等極性分子快速震動，使細胞內DNA分子氫鍵和堿基堆積化學力受損，DNA結構發生變化，從而發生遺傳變異[14]。同時，微波誘變具有設備簡單、操作安全和正突變率較高，以及在短時間內能夠獲得大量的突變體等優點[15]。鑒于以上優點，到目前為止國內外關于微波誘變進行木霉菌功能改良已有一些研究，并取得了顯著成效。秦濤等[16]對以產纖維素酶的綠色木霉(T.viride)A10進行微波誘變，獲得多次傳代后遺傳性狀穩定、較出發菌株濾紙酶活力和羧甲基纖維素酶活力分別提高了34.3%和32.4%的突變菌株WB6；趙靖等[17]通過微波誘變對一株產纖維素酶的木霉菌YM進行了改造，篩選出5株纖維素酶高產菌株，其平均纖維素酶活力較原始菌株提高了35%，其中酶活力最高的菌株MW6纖維素酶產量較原始型菌株提高了40%。這些研究說明微波誘導產生的突變菌株具有增產明顯、遺傳穩定的優點。但是，目前使用微波誘變進行木霉菌株功能改良方面的研究主要集中于選育高產纖維素酶菌株方面，尚未見高效溶磷菌株選育的報道。

因此，本研究擬以前期分離篩選得到的具有溶磷和拮抗作用的木霉T6菌株為試材，通過微波誘變處理，以期獲得高效溶磷和較強拮抗作用的多功能突變菌株，為今后多功能木霉制劑的研發奠定基礎。

1　材料與方法

1.1試驗材料

供試菌株出發菌株木霉菌株T6為甘肅農業大學植物病理學實驗室分離保存，具有溶解無機磷(Ca3(PO4)2)和拮抗雙重作用。

培養基PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，去離子水1 000 mL，瓊脂粉10 g，用于菌種的保存活化。NBRIP培養基：葡萄糖10 g，磷酸鈣10 g，六水氯化鎂5.0 g，七水硫酸亞鐵0.25 g，氯化鉀0.2 g，硫酸銨0.1 g，pH值7.0～7.5，固體培養基加2%的瓊脂粉，用于解磷能力測定。

1.2試驗方法

1.2.1菌種的活化將實驗室預先分離保存的木霉菌株T6轉接于PDA培養基中，置于28℃恒溫培養箱中培養5 d。

1.2.2孢子懸浮液的制備待產生大量分生孢子后，用一定量的去離子水洗下菌落表面的木霉孢子，將孢子液收集于盛有玻璃珠的100 mL三角瓶中，置于200 rpm的搖床上振蕩30 min，使孢子分散均勻，然后用6～7層擦鏡紙過濾，制成分生孢子懸浮液，調節孢子濃度至106cfu·mL-1備用。

1.2.3微波誘變處理取預先制備好的分生孢子懸浮液10 mL倒入50 mL三角瓶中，將三角瓶置于盛有冰塊的燒杯中，在最小功率80 W，最大功率1 200 W，額定微波頻率2 450 MHz的HairMD-2480EGC型微波爐中進行輻照處理，輻照功率分別為600、900 W和1 200 W，輻照時間為0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 s和100 s，采用冰浴法消除熱效應，每累計照射5 s需將菌液取出，在冰上冷卻5 s后再進行照射。然后取微波處理過的孢子懸浮液涂布于NBRIP固體培養基上，28℃恒溫培養7 d，每個處理和對照均為3次重復。培養7 d后，分別統計單菌落數、單菌落直徑和溶磷透明圈直徑，并計算其致死率和正突變率，確定最佳誘變條件。

致死率(%)=(對照菌落數-處理菌落數)/對照菌落數×100

正突變率(%)=(溶磷能力提高的突變株數目/突變株總數)×100

1.2.4突變株初篩和復篩在最佳誘變條件下對出發菌株進行微波誘變處理，將誘變處理過的孢子懸浮液稀釋成一定的濃度梯度，涂布在NBRIP固體培養基上，28℃恒溫培養7 d，以溶磷圈直徑(d′)與菌落直徑(d)比值大于原始菌株d′/d比值作為初篩標志進行溶磷突變株的初篩。將初篩獲得的菌株和原始菌株分別接種到PDA培養基上，28℃恒溫培養5 d，配制成濃度為106CFU·mL-1的孢子懸浮液，取1 mL孢子懸浮液接種于NBRIP液體培養基中，置于28℃，150 rmp搖床震蕩培養15 d后測定溶磷量和植酸酶活性。

1.2.5溶磷量和植酸酶活性的測定溶磷能力的測定采用磷礬鉬黃比色法[18-19]；植酸酶活性測定采用Heinonen和Lahti[20]的方法。

1.2.6溶磷突變菌株遺傳穩定性測定將酶活性和溶磷能力明顯提高的3株木霉突變菌株分別接種于PDA培養基上，25℃培養5 d記為第1代。然后，每間隔5 d，以PDA培養基傳代1次，接種于NBRIP液體培養基振蕩培養14 d，共傳代4次，測定每代各菌株的溶磷量和植酸酶活性。

1.2.7突變菌株拮抗試驗對尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)的拮抗作用采用對峙平板法，即將突變木霉菌株T6-157分別與2種病原菌對峙接種在PDA平板兩端，兩接種點距離中心2 cm，菌餅直徑6 mm，以單獨接種病原菌株作為對照。每個處理重復3次，置于25℃恒溫箱中培養7 d，測量病原菌落中心指向木霉菌落半徑的相向距離以及對照病原菌落半徑，并計算其抑菌率。

抑菌率(%)=[(病原菌對照菌落半徑-病原菌落中心指向木霉菌落半徑的相向距離)/病原菌對照菌落半徑]×100，這個公式需要考慮接種的菌餅半徑。

對禾谷胞囊線蟲(Heteroderaavenae)的抑制作用，在高溫滅菌的培養皿(d=6 cm)中放入10個表面消毒且發育較一致的胞囊，加入5 mL濃度為1.5×106CFU·mL-1木霉突變菌株T6-157孢子懸浮液，以加入5 mL無菌水作為對照，處理和對照均為3個重復。試驗在25℃下進行，10天后鏡檢各處理中胞囊被寄生和孵化情況，并按照下列公式計算胞囊寄生率和胞囊孵化的相對抑制率。

胞囊的寄生率(%)=處理胞囊寄生的數量/供試胞囊的數量×100

胞囊孵化的相對抑制率(%)=(對照孵化的線蟲數量-處理孵化的線蟲數量)/對照孵化的線蟲數量×100

2　結果與分析

2.1微波誘變對木霉菌T6活性的影響及誘變條件的確定

微波輻射功率和時間對菌體致死率的影響反映了菌種耐受微波的能力。由圖1可以看出，不同功率的微波輻照處理對木霉菌T6活性的影響不同，隨著輻照功率的增大和輻照時間的延長其致死率逐漸增大。在試驗所選用的600、900、1 200 W三個輻照功率中，木霉菌T6在1 200 W功率輻照下，致死率最高；在900 W功率輻照下，致死率次之；在600 W功率輻照下，致死率最低。在900 W功率下，輻照10 s木霉菌的致死率較低，僅為3.52%；輻照70 s時，其致死率為91.39%；當輻照80 s、90 s和100 s時，其致死率分別為99.02%、99.37%和99.87%，接近100%，幾乎全部死亡，說明木霉T6菌株的孢子對微波較為敏感，致死效應明顯。

圖1微波輻照對木霉孢子的致死率

Fig.1Fatality rate of microwave irradiation onTrichodermaspores

不同功率微波輻照木霉菌后，其正突變率均隨著輻照時間的延長先增加后降低，呈現出單峰趨勢。輸出功率為600 W，輻照為80 s時達到62.57%；輸出功率提高到900 W時，相同處理時間內的正突變率均高于600 W的正突變率，70 s時達到最大值85.46%；當輸出功率提高到1 200 W時，正突變率比較低，尤其輻照30 s后接近于0(圖2)。可見，900 W輸出功率輻照70 s為木霉T6菌株的最佳誘變條件，正突變率達到最大值(85.46%)，而此時菌株的致死率較高，為91.39%。

圖2微波輻照對木霉孢子的正突變率

Fig.2The positive mutant rate of microwave irradiation onTrichodermaspores

2.2溶磷木霉突變菌株的初篩

在900 W和70 s的最佳誘變條件下，從220株中篩選獲得解磷圈直徑(d′)與菌落直徑(d)比值大于出發菌株d′/d比值的菌株8株，分別為T6-9、T6-33、T6-93、T6-126、T6-157、T6-188、T6-196和T6-203。其中，T6-188菌株的d′/d比值最大，為1.51，與出發菌株相比，提高了46.6%，T6-157菌株次之，比值為1.48，較對照提高率為46.6%，T6-9菌株的比值最小，較對照提高率僅為10.7%(表1)。

表1　微波誘變處理后溶磷木霉突變菌株初篩結果

2.3溶磷突變菌株的復篩

結果表明，8株微波誘變的突變菌株的溶磷量和植酸酶活性較未經微波誘變的出發菌株都有所提高，T6-188、T6-157和T6-196共3個菌株的溶磷量和植酸酶活性明顯高于出發菌株，以T6-188菌株的溶磷量和植酸酶活性為最高，達206.7 mg·L-1和558 nmol·L-1，分別較出發菌株提高了110.25%和60.81%；其次為T6-157菌株，溶磷量和植酸酶活性分別為204.46 mg·L-1和546 nmol·L-1，較出發菌株分別提高了107.97%和57.35%；T6-196菌株的溶磷量和植酸酶活性最小，分別為172.27 mg·L-1和481 nmol·L-1，與出發菌株相比，提高了75.23%和38.62%(圖3)。

圖3　8株突變菌株液體培養條件下的解磷能力

圖48株木霉突變菌株在液體培養條件下植酸酶活性測定結果

Fig.4Phytase activity of 8Trichodermamutant strains in liquid culture

2.4溶磷突變菌株遺傳穩定性

由表2可知，T6-188和T6-196菌株都不穩定，尤其是T6-188菌株在培養1代后的溶磷量和植酸酶活性很高，保持在原來水平，但在不斷轉接培養過程中，其溶磷量和植酸酶活性不斷下降，培養5代后的溶磷量和植酸酶活性僅為174.75 mg·L-1和326 nmol·L-1；而突變菌株T6-157相對比較穩定，培養5代后的溶磷量和植酸酶活性都基本保持不變，分別仍然保持在204.93 mg·L-1和552 nmol·L-1。

表2　突變菌株溶磷能力的遺傳穩定性

2.5溶磷突變菌株拮抗效果

從表3可知，通過微波誘變得到的木霉T6-157菌株對2種病原菌和小麥禾谷胞囊線蟲的拮抗能力有了進一步的提高。突變菌株T6-157與出發菌株T6相比，對尖孢鐮刀菌和立枯絲核菌的抑制率分別提高了11.83%和10.39%，且突變菌株T6-157與出發菌株T6的抑菌率差異顯著(P<0.05)；對禾谷胞囊線蟲胞囊的寄生率和胞囊孵化相對抑制率分別由原來的91.2%和90.8%提高到了92.3%和91.5%，但差異不顯著(P<0.05)。

表3　溶磷木霉突變菌株T6-157對土傳病原菌的拮抗作用

注：不同字母表示在P<0.05水平差異顯著。

Note: Different letters in the same column indicate significant differences atP<0.05.

3　討　論

微波誘變作為一種新型誘變方法，由于其能夠在短時間內得到優良高效、性質穩定的突變株，且與傳統的誘變育種手段相比，可以大幅提高菌種單位，減少突變率低和突變譜窄等弊端，目前在微生物菌種改良方面已廣泛應用[21]。本研究通過微波誘變處理，獲得了1株遺傳穩定的高效溶磷木霉菌株T6，其液體培養條件下的溶磷量為204.46 mg·L-1，與出發菌株相比溶磷能力提高了107.97%，與楊合同等[22]分離到的木霉T13-8和T-23菌株的溶磷能力基本一致，高于張曼曼等[23]從土壤中分離到的擬康氏木霉(T.koningiopsis)T-404菌株的溶磷能力。因此，利用微波誘變對木霉高效溶磷菌株進行選育具有可行性。

誘變過程中誘變結果受菌種特性、誘變條件等多種因素的影響。李劍峰等[20]研究發現微波輸出功率和誘變時間分別為600 W和30 s時可以獲得苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti)高效溶磷突變株，其溶磷能力較原始菌株提高了112.59%。本試驗證明木霉T6菌株在微波輸出功率900 W、輻照時間70 s的條件可以獲得高效溶磷能力的突變株，這主要是因為微波誘變過程中微波對細胞內物質形成的損傷程度不同，造成了不同的微生物對微波的反應有差別[24]。另外，由于微波的生物效應分為熱效應和非熱效應。熱效應可以導致實驗菌株的死亡，此時微波對實驗菌株的致死率明顯，而對微生物產生誘變作用的主要是非熱效應[25]。因此，為了極大限度地消除微波的熱效應，本研究在對孢子懸浮液進行輻照過程中采用間歇誘變的方法，即每累計照射5 s將孢子懸浮液取出，在冰上冷卻5 s后再進行照射，使孢子懸液在誘變過程中系統溫度始終處在較低水平，提高了對菌株的誘變效率，也凸顯了非熱效應的誘變效應。

本試驗通過對微波誘變獲得的1株具有高效穩定溶磷能力木霉突變菌株拮抗活性的測定，表明其對立枯絲核菌(R.solani)、禾谷鐮刀菌(F.oxysporum)和禾谷胞囊線蟲(H.avenae)等主要土傳病害病原菌的拮抗能力并無消減。這說明木霉菌T6菌株對微波輻照敏感，誘變效果較好，可以通過微波輻照處理對野生木霉菌株進行改良，獲得高效優質的溶磷木霉突變菌株。同時，以物理誘變方式增強其溶磷效果，使目的菌株同時具備溶磷和拮抗的雙重能力，彌補現有木霉菌劑效果單一的缺陷，擴大了木霉菌的應用范圍。因此，微波誘變在多功能木霉菌菌種的選育中具有較大的推廣價值和廣闊應用前景，但在木霉T6菌株復合誘變提高其溶磷能力和對所獲得的突變菌株T6-157田間應用效果等方面有待繼續深入研究。

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Screening ofTrichodermasp. strain for high phosphorus solubilization using microwave mutagenesis

XUE Ying-yu, YE Wei, ZHANG Shu-wu, LIU Jia, XU Bing-liang

(CollegeofPlantProtection,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,Gansu730030,China)

In order to obtainTrichodermasp. strain with high phosphorus dissolving efficiency, the original strain, Trichoderma T6 with low ability in dissolving phosphorus, was mutated by microwave. The microwave mutagenesis parameters were optimized, and the genetic stability, phosphate solubilizing power and antibiotic ability of the mutant were investigated. The results showed that the optimum mutagenic method was with an irradiation power at 900 W and a mutation time of 70 s. 8 stains with high phosphorus solubilizing capability named T6-9, T6-33, T6-93, T6-126, T6-157, T6-188, T6-196 and T6-203 were obtained using the optimized mutagenic method. After several generations, a strain named T6-157 with relatively stable hereditary was eventually obtained, exhibiting high phosphorus solubilizing capability. The highest phosphate solubilizing power of mutant strain T6-157 was 204.46 mg·L-1, and the phosphate solubilizing power and phytase activity were increased by 107.97% and 57.35%, respectively, compared with the original strain. The antagonistic ability against the main soil-borne pathogens was higher than that of the initial strain T6.

Trichodermasp.; microwave mutagenesis; phosphate solubilization capacity; antagonistic effect

1000-7601(2016)04-0231-06

10.7606/j.issn.1000-7601.2016.04.35

2015-06-20

甘肅省高校基本科研業務費項目資助(甘財教[2012]129號)；甘肅省教育廳高校科研項目資助(2013A-061)；甘肅省自然科學基金項目(145RJZA095)；甘肅農業大學科技創新基金資助項目(GAU-CX1014)

薛應鈺(1978—)，男，甘肅鎮原人，博士，副教授，研究方向為植物病害生物防治。 E-mail:xueyy@gsau.edu.cn。

徐秉良(1962—)，女，浙江桐鄉人，博士，教授，研究方向為植物病害綜合治理。 E-mail:xubl@gsau.edu.cn。

Q936

A