吉林地區(qū)豬鏈球菌的分離及快速檢測方法的建立

宋永利，尹柏雙，付連軍，劉立明，沙萬理，王 奔，李靜姬

(吉林農業(yè)科技學院動物科技學院，吉林吉林 132101)

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吉林地區(qū)豬鏈球菌的分離及快速檢測方法的建立

宋永利，尹柏雙，付連軍，劉立明，沙萬理，王 奔，李靜姬

(吉林農業(yè)科技學院動物科技學院，吉林吉林 132101)

從吉林市周邊地區(qū)8個豬場收集病料，采集疑似豬鏈球菌的豬樣品，進行病原菌的分離、生化試驗、動物致病性試驗和毒力因子的PCR檢測。共分離到8株分離株，其中3株有致病性，5株無致病性。PCR能夠高效、快速診斷出該病菌是否有致病性。該試驗結果可為正確及時診斷治療鏈球菌病提供理論依據(jù)。

豬鏈球菌；分離；生化試驗；動物致病性試驗；PCR檢測

豬鏈球菌病是我國常見的豬傳染病，危害嚴重，并且出現(xiàn)人感染豬鏈球菌的報道，引起人們的極大關注。豬鏈球菌血清型較多，防治較為困難。針對豬鏈球菌病的防治，國內外大多采用藥物治療和免疫相結合的方法。在發(fā)病初期一般采用抗生素治療，但由于沒有進行有效的藥敏試驗，導致抗生素的濫用，延誤了最佳的治療時間，并且有畜產(chǎn)品抗生素殘留的隱患[1]。因此，應致力于篩選廣譜、高效、低殘留的抗菌藥物，在疾病發(fā)生早期及時控制疫情的蔓延。豬溶血素使細菌產(chǎn)生致病力，是許多細菌產(chǎn)生的重要毒力因子[2-3]。研究表明，GAPDH與豬鏈球菌對宿主細胞的黏附有關[4]。GAPDH具有結合白蛋白的能力，并且豬鏈球菌結合白蛋白后能增強菌株的毒力。Chen C等[5]研究表明在我國豬鏈球菌流行株中存在1個86 kb大小的基因組毒力島，含有2個雙組分信號轉導系統(tǒng)，通過調控多種毒力因子的表達參與致病過程。李干武等[6]利用PCR技術首次從我國江蘇分離株HA9801中檢測到渾濁因子(orf2)，同時發(fā)現(xiàn)orf2還存在于其他血清型的鏈球菌豬源分離株中。豬鏈球菌在血清肉湯和THB液體培養(yǎng)基中有白色絮狀沉淀產(chǎn)生[7]。生化試驗可用于豬鏈球菌的鑒定，但是不同血清型的豬鏈球菌或同一血清型不同菌株間的生化結果差異較大，因此生化鑒定只能作為補充性鑒定方法[8]。徐敏等[9]利用純化的原核表達豬鏈球菌高保守的GDH蛋白的表位區(qū)域作為抗原，建立間接ELISA方法，該方法特異、敏感，能夠準確檢測出所有亞血清型豬鏈球菌的抗體，為流行病學調查提供了一個有效的診斷方法。倪艷秀等[10]根據(jù)豬鏈球菌2型的莢膜多糖基因cps2J設計合成了1對引物，建立了檢測豬鏈球菌2型的PCR法，該方法不需要進行細菌的分離純化，檢測時間短，適合實驗室對大批樣本進行檢測診斷，為流行病學調查提供依據(jù)。筆者從吉林市周邊地區(qū)8個豬場收集病料，進行病原菌的分離，并進行生化試驗、動物致病性試驗和毒力因子的PCR檢測，對當?shù)仞B(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展和鏈球菌病的預防具有積極意義。

1　材料與方法

1.1樣品采集從吉林市周邊地區(qū)8個豬場收集病料，采集疑似感染豬鏈球菌病豬的樣品。

1.2試劑與儀器PCR mix購自Tiangen公司；DNA Marker購自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；常用培養(yǎng)基購自Oxoid公司。試驗儀器有PCR儀(ABI9700)。

1.3試驗方法

1.3.1致病原分離。無菌采集疑似鏈球菌感染的病死豬肝、腎、脾，淋巴結，接種于馬丁肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃下培養(yǎng)1 d后，在培養(yǎng)基中挑選生長出的可疑菌落，將可疑菌落用記號筆進行標記，在低倍鏡下觀察，挑取每一個菌落少許，革蘭氏染色。將革蘭氏陽性、成雙或短鏈狀球菌的肉湯培養(yǎng)物接種于血清平板上，經(jīng)過培養(yǎng)、鏡檢確定為鏈球菌后，接種于含有血清的馬丁肉湯、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基THB培養(yǎng)基中，無菌檢驗合格者，加入甘油于-20 ℃下保存。如果是可疑菌落，經(jīng)過純培養(yǎng)后，進一步進行其他試驗鑒定。

1.3.2生化試驗。將上述純化的肉湯培養(yǎng)物接種于馬丁瓊脂斜面，培養(yǎng)后用滅菌鹽水沖洗，將菌液收集于滅菌試管，供生化試驗用。待測菌株分別用接種針接種到生化編碼鑒定管。將接種后的生化鑒定管置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，觀察并記錄結果。重復3次。混合，37 ℃下作用18～24 h后觀察結果。

1.3.3動物致病性試驗。取每個菌株18 h血清馬丁肉湯培養(yǎng)物稀釋成1∶15勻漿懸液，對3只小鼠進行腹腔注射，0.3 mL/只，同時取3只小鼠腹腔注射同劑量的血清馬丁肉湯，作為對照。將注射后的小鼠單獨飼養(yǎng)，觀察發(fā)病及死亡情況，對死亡的小鼠進行解剖，條件下摘取無菌肝臟和脾臟，革蘭氏染色，并在鮮血瓊脂平板上分離培養(yǎng)。

1.3.4豬鏈球菌分離株毒力因子的PCR檢測。參照朱子潔[11]的方法設計1對引物F(GCTACGACCTCAGGCTGAAAC)和R(TGGATCCAAGTGTCACTGTAC)，對ef進行PCR擴增。PCR反應體系如下：引物各1 μL、mix 6 μL、模板1 μL、水3 μL。PCR反應條件如下：95 ℃ 30 s；95 ℃4 min，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min；72 ℃延伸7 min,35個循環(huán)。

2　結果與分析

2.1分離菌的培養(yǎng)特性通過鏡檢發(fā)現(xiàn)，致病原為革蘭氏陽性球菌，多數(shù)為圓形，少數(shù)呈短鏈狀，有莢膜。在血清肉湯中先均勻混濁，后在試管底部形成沉淀，血清肉湯培養(yǎng)物涂片，可見革蘭氏染色陽性，多呈長鏈狀的球菌。致病菌的培養(yǎng)特性如表1所示，符合鏈球菌的培養(yǎng)特性。

表1　致病原的培養(yǎng)特性觀察

注：-表示生長不好；+表示生長良好。

Note：- indicated poor growth;and + indicated good growth.

2.2生化試驗結果菌株5、6、8可發(fā)酵乳糖，不發(fā)酵山梨醇；菌株1、2、3、4、7不產(chǎn)生H2S。生化試驗結果表明，分離菌株符合豬鏈球菌的生化特性(表2)，證實了豬鏈球菌病的存在。

表2　致病原的生化試驗結果

2.3致病性試驗結果將分離培養(yǎng)的菌液經(jīng)純化培養(yǎng)后，接種于小鼠體內，在不同時間內小鼠的表現(xiàn)不同，在不同時間內小鼠發(fā)生死亡，接種菌液5、6、8后在24 h內小鼠死亡，接種1、2、3、4、7號菌液的小鼠沒有發(fā)生死亡。死亡小鼠經(jīng)剖檢發(fā)現(xiàn)腎臟腫大、關節(jié)腫大，肝臟、肺臟有出血點。

2.4分離株毒力因子的PCR檢測從圖1可以看出，5、6、8號菌液擴增出606 bp大小的ef條帶，而1、2、3、4、7號菌液沒有擴增出條帶，說明1、2、3、4、7號菌液無致病性。經(jīng)測序比對，與NCBI上的ef序列相一致,且5、6、8號菌液也符合鏈球菌的培養(yǎng)特性。這驗證了PCR在鑒定致病性鏈球菌方面的準確性。

圖1　分離株毒力因子ef的PCR檢測Fig.1　PCR detection of virulence factor ef in isolated strain

3　小結

豬鏈球菌的致病性與其毒力因子密切相關，鑒于毒力因子檢測在該病臨床診斷及流行病學監(jiān)測中的重要價值，筆者從吉林市周邊地區(qū)8個豬場收集病料，進行病原菌的分離以及生化試驗、動物致病性試驗和毒力因子的PCR檢測，旨在實現(xiàn)對吉林市地區(qū)豬鏈球菌分離菌株的毒力相關因子的檢測，以期為該地區(qū)快速診斷該疾病提供實驗室診療方法，減少豬鏈球菌病給吉林周圍地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)帶來的損失。

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[5]CHEN C,TANG J,DONG W,et al.A glimpse of streptococcal toxic shock syndrome from comparative genomics of S.suis 2 Chinese isolates[J].PLoS One ,2007,2(3):315.

[6]李干武,姚火春,陸承平.在豬鏈球菌 2 型江蘇分離株中發(fā)現(xiàn)新的 orf2 毒力相關基因[J].農業(yè)生物技術學報,2003,11(3):295-298.

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[10]倪艷秀,何孔旺,王繼春,等.豬鏈球菌 2 型的 PCR 快速檢測[J].中國獸醫(yī)學報,2002，22(5):474-476.

[11]朱子潔.石家莊地區(qū)豬鏈球菌的分離鑒定及其快速檢測方法的建立和應用[D].保定：河北農業(yè)大學，2008.

Isolation and Rapid Detection of Streptococcus suis in Jilin District

SONG Yong-li,YIN Bai-shuang,FU Lian-jun et al

(College of Animal Science and Technology,JILin Agriculture Science and Technology College,Jilin,Jilin 132101)

Suspected samples of Streptococcus sui were collected from 8 pig farms in the surrounding areas of Jilin City.The isolation,biochemical test,animal pathogenicity test and the virulence factor PCR test of pathogenic bacteria were carried out.A total of eight strains were isolated.And among them,3 strains had pathogenicity,others were non-pathogenic.RCR could rapidly and efficiently diagnose whether the strain had pathogenicity.This research provided theoretical basis for the correct and timely treatment of Streptococcus suis.

Streptococcus suis;Isolation;Biochemical test;Animal pathogenicity test;PCR detection

吉林農業(yè)科技學院重點學科培育項目[吉農院合字(2013)第X028號]。

宋永利(1983- )，男，內蒙古呼和浩特人，講師，碩士，從事分子生物學與胚胎工程研究。

2016-07-03

S 851.34+7

A

0517-6611(2016)25-131-02