赤點石斑魚FAS基因的克隆及序列分析

陳斯鈺,張 芮,楊云霞

(浙江海洋大學水產學院,浙江舟山 316022)

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赤點石斑魚FAS基因的克隆及序列分析

陳斯鈺,張 芮,楊云霞*

(浙江海洋大學水產學院,浙江舟山 316022)

[目的]研究赤點石斑魚 (Epinephelus akaara) FAS基因的結構與表達特性。[方法]以前期獲得的轉錄組序列作為數據庫，應用PCR技術，獲得赤點石斑魚FAS 基因的cDNA全序列。[結果]該序列與大黃魚(Larimichthy scrocea)FAS基因的相似度最高，為87%。該序列全長8 505 bp，包括712 bp的3′UTR區、7 548 bp的開放閱讀框(ORF)以及245 bp的5′UTR區，可編碼2 515個氨基酸。經預測，該蛋白分子量為274.03 ku，等電點為5.98，其屬于親水性蛋白。通過Real-time PCR方法獲得FAS在赤點石斑魚各個組織中的表達，結果顯示，其在心臟中表達量最高，其次是在肝臟中。FAS基因的進化與物種進化一致。[結論]該研究為進一步研究赤點石斑魚脂肪代謝奠定理論基礎，也為赤點石斑魚在養殖方面的工作提供基礎資料。

赤點石斑魚；FAS基因；組織分布

赤點石斑魚(Epinephelus akaara)俗稱紅斑、紅過魚，隸屬于鱸形目(Perciformes)鮨科(Serranidae)石斑魚屬(Epinephelus)，是我國南方名貴的經濟養殖魚類[1]。其屬于亞熱帶暖溫性底層魚類，多生活于巖礁底質的海域，一般不結成大群，喜光線較暗區域，主要攝食魚類和蝦類[2]，主要分布于北太平洋西部，我國產于舟山群島以南經臺灣海峽至南海、北部灣一帶海域。赤點石斑魚富含EPA、DHA等高不飽和脂肪酸，可預防心血管等疾病發生。赤點石斑魚肉味鮮美，又因人們認為其身上的紅斑為吉祥之意，故市場上售價很高，是香港、廣東的主要養殖品種[3]。

FAS(fatty acid synthetase)基因是生物體內脂肪酸合成的關鍵酶，當其表達水平和活性升高時，會顯著增加甘油三脂在體內的沉積[4-6]；當其活性受到抑制時，會阻滯生脂通路、減少脂肪的合成，還會造成丙二酰COA濃度的升高，降低食欲[7]。為深入了解FAS基因，很多學者對FAS功能、表達活性、調控機制等方面進行了研究[8-14]。迄今為止，人們已分離得到人脂肪酸合成酶代謝調控基因，發現其脂肪酸合成酶基因位于17q25[15]，另外，牛的基因位于19q22，雞的基因位于18號染色體上[16]。此外，還有學者對綿羊肌肉中FAS基因表達的發育性變化進行了研究，發現FAS基因mRNA水平在哈薩克羊肌肉中初生時最高(P<0.05)，隨日齡的增加呈下降趨勢；在新疆細毛羊肌肉中，FASmRNA水平則表現出“下降-上升-下降-上升”的發育模式，其中，60日齡顯著高于90日齡(P<0.05)，其余日齡之間差異不顯著[17]。另有學者研究了不同填飼期肥肝鵝肝臟組織中不同脂肪酸沉積與脂肪酸合成酶FAS基因mRNA的表達豐度及相關性，發現FAS基因mRNA的表達對肥肝鵝肝臟中脂肪的沉積具有填飼前、中期快速增加，填飼后期下降的調控作用[18]。熊文中等[19]研究發現，豬脂肪組織中脂肪酸合成酶和酮體脂肪量具有極顯著(P<0.01)的正相關關系。

關于FAS基因在哺乳動物上的研究已很深入，而在魚類上，研究者對FAS的研究僅局限于FAS活性研究，對其基因研究相對較少。目前，GenBank 數據庫上僅見預測的斑馬魚 Danio rerio FAS基因mRNA全序列 (GenBank:XM_001923608.2) 以及吉富羅非魚 Oreochromis niloticus (GenBank:GU433188.1)、黑鯛 Acanthopagrusschlegelii (GenBank:EU780581.1)、軍曹魚 Rachycent roncanadum (GenBank:FJ842647.1)、點帶石斑魚Epinephelus coioides (GenBank:FJ196231.1)、黑青斑河豚 Tetraodonnigroviridis (GenBank:CAF94659.1)等少數魚類的FAS基因部分mRNA序列。關于赤點石斑魚的FAS基因，目前尚未見相關方面的研究。筆者以赤點石斑魚為研究對象，研究赤點石斑魚FAS基因的克隆及序列分析，為進一步研究赤點石斑魚脂肪代謝奠定理論基礎，也為赤點石斑魚在養殖方面的工作提供基礎資料。

1　材料與方法

1.1試驗材料赤點石斑魚來自浙江海洋大學分子生物學實驗室。將赤點石斑魚暫養7 d后，選擇外觀無明顯病狀、較為健康的赤點石斑魚。在超凈工作臺上進行無RNA操作：將其解剖后，獲得頭腎、腦、腸、脾、腹肌、肝、鰓、胃、心臟、背肌等組織。將各組織用錫箔紙包裹，做好標記后，放入-80 ℃的冰箱中冷凍保存備用。

1.2引物設計在NCBI網站上下載與赤點石斑魚相似的其他魚類FAS基因序列，即大黃魚 (Larimichthys crocea KP889061.1)、軍曹魚(Rachycentron canadum FJ842648.1)、羅非魚 (Oreochromis niloticus GU433188.1)、南極鱈魚 (Notothenia coriiceps XM_010792091.1) 的FAS基因序列，遵循引物設計原則，采用引物設計軟件Primer Premier 5.0[20]和評估軟件PrimerSelect設計上、下游引物。由測序結果獲得FAS基因片段，同時結合轉錄組測序的結果，獲得赤點石斑魚FAS基因的開放閱讀框(Open read frame ,ORF) 序列,設計半定量RT-PCR反應引物。引物序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。EA-fas-CF：3′-CTTGATGGGTGTGGAGGTTCG-5′，EA-fas-CR：3′-AGTCTCGGCTGATGTTCTTGTG-5′；EA-fas-RT-ZF：3′-GCCAACAGCAAGCCAGAATCTC-5′，EA-fas-RT-ZR：3′-GCAGCAGTGGAGCCCTCAAT-5′；β-actin-F：3′-CGACCTCACAGACTACCT-5′，β-actin-R：3′-AACGGAACCTCTCATTGC-5′。

1.3試驗方法

1.3.1總RNA的提取并檢測。取各新鮮組織于Eppendorf 離心管中,采用Trizol法，通過取樣、處理、去蛋白、沉淀、洗滌、干燥、溶解等步驟，提取各個組織的總RNA。并將所提取的總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.2cDNA模板的制備及FAS基因序列全長的獲得。根據RNA的檢測濃度，取各組織RNA 2 μL于Eppendorf離心管中，再加入2.0 μL Buffer、0.5 uL oligo(dT)、0.5 μL Random.6、0.5 μL mix，最后加4.5 μL RNase FreedH2O補足。將PCR儀反應程序設置為37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃后，進行反轉錄，得到cDNA，最后加入40.0 μL ddH2O進行稀釋，獲得cDNA模板，放入4 ℃冰箱中備用。

利用合成的引物(EA-fas-CF、EA-fas-CR)，并結合腦、胃、心臟等模板進行中間片段的PCR擴增。根據說明書添加如下反應體系：10×Buffer 3.0 μL、dNTP 2.0 μL、上下引物各0.4 μL、rTaq 0.2 μL、模板0.6 μL、ddH2O 23.4 μL。PCR擴增反應程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；最后72 ℃延伸8 min。當PCR擴增結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇檢測結果具有明亮條帶的PCR產物，送上海生工生物工程技術服務有限公司進行純化、克隆，獲得基因序列，再以實驗室前期獲得的轉錄組序列作為數據庫，搜索獲得FAS基因序列，并通過NCBI數據庫Blast程序進行序列驗證。

1.3.3RT-PCR擴增。以β-actin作為參考基因，重新設計RT-PCR引物(EA-fas-RT-CF、EA-fasR-T-CR)，以腦、腸、脾、腹肌、肝、鰓、胃、心臟、背肌作為模板進行RT-PCR擴增。每個樣品進行3次重復擴增，每組反應體系：premix 7.5 uL、模板 1.0 μL、上下引物各0.6 μL、ddH2O 6.3 μL。RT-PCR擴增反應程序：95.5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。

1.4數據分析所得數據采用2-ΔCt法，計算FAS基因在赤點石斑魚各組織中的相對表達量。

2　結果與分析

2.1總RNA檢測結果將所提取的總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖1。由圖1可知，在每個組織中均能觀察到28S、18S、5S 3條明亮、清晰的條帶。

注：1.腦；2.腸；3.脾；4.腹肌；5.肝；6.鰓；7.胃；8.心臟；9.背肌。Note: 1.Brain;2.Intestine;3.Spleen;4.Abdo minal muscle;5.Liver;6.Gills;7.Stomach;8.Heart;9.Back muscle.圖1　赤點石斑魚9個組織的總RNA電泳分析Fig.1　Electrophoretic analysis of total RNA expression in nine tissues of Epinephelus akaara

2.2FAS基因cDNA全長序列及其編碼氨基酸序列利用赤點石斑魚肝臟的轉錄組數據，以及與其他物種FAS基因序列，通過PCR擴增和克隆測序分析，拼接得到cDNA全序列長度為8 505 bp。由ORF-Finder檢索得到，該序列由7 548 bp編碼區、712 bp的3′UTR區和245 bp的5′UTR區組成，共編碼2 515個氨基酸。經ProtParam (http://web.expasy.org/ protparam)軟件分析，預測赤點石斑魚FAS蛋白質分子量為274.03 ku，等電點為5.98。利用ProtScale (http://web.expasy.org/protscale)在線預測赤點石斑魚FAS的氨基酸親/疏水性，結果顯示，赤點石斑魚FAS蛋白序列中疏水性氨基酸殘基所占面積小于親水性氨基酸殘基，其中，疏水性最大值為2.689，親水性最大值為3.000，可以推測該蛋白屬于親水性蛋白。此外，經過SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)在線預測，得知FAS蛋白有2個特有的結構域，一個是PKS_ER 結構域(位于第1 549～1 864個氨基酸)；另一個是PKS_KR結構域(位于第1 896～2 077個氨基酸)。

2.3FAS基因的同源性和系統進化分析利用NCBI數據庫Blast程序進行序列驗證，結果顯示，該序列與大黃魚(Larimichthy scrocea)、深裂眶鋸雀鯛(Stegastes partitus)、羅非魚(Stegastes partitus)等的FAS基因核苷酸序列均有較高的相似度，分別為87%、86%、83%。選取NCBI上已知的魚類及其他高等脊椎動物的FAS基因序列，運用軟件ClustalX進行多序列比對分析，并以MEGA5.1軟件中的鄰接法(Neighbor Joining)構建多物種的FAS基因系統發生樹(圖2)。由圖2可知，所獲得的進化樹由2個主要分支組成，其中一支主要分支又分為兩分支，一支為各種魚類，一支為原雞和熱帶爪蟾，另一支主要分支為人和小鼠。

圖2　基于FAS氨基酸序列構建脊椎動物系統進化樹(NJ樹)Fig.2　Phylogenetic tree of vertebrates based on FAS a mino acid sequence

2.4赤點石斑魚FAS基因在各組織中的差異表達為研究赤點石斑魚不同組織FAS表達的差異性,通過RT-PCR對赤點石斑魚9個組織的FAS相對表達量進行檢測。結果表明，FAS基因在各個組織中均有表達(圖3)，但不同組織中的表達量明顯不同，心臟中相對表達量最高，為0.069；其次是肝和腸，表達量分別為0.017和0.015；而腦與脾的表達量相同，均為0.011；在腹肌、鰓、胃、背肌中的相對表達量差異不大，分別為0.007、0.003、0.002、0.003。

圖3　赤點石斑魚FAS基因在不同組織中的表達情況Fig.3　Tissue expression of FAS gene in different tissues of Epinephelus akaara

3　討論

脂肪酸合成酶是一種多功能酶復合物，在動物生命活動中發揮重要作用，其最早是在鵝的肝臟中發現的，隨后研究者對人、鼠、豬、牛也進行了相關方面的研究[21-23]。該研究獲得FAS基因全序列，其全長為8 505 bp，由712 bp的3′UTR區、7 548 bp的開放閱讀框(ORF)以及245 bp的5′UTR區組成，共編碼2 515個氨基酸。該序列與大黃魚FAS基因序列相似度最高，為87%，其高度保守性揭示魚類FAS蛋白可能具有相似的功能和特性，在動物生長過程中起重要作用。經預測，FAS蛋白屬于親水性蛋白，蛋白分子量為274.03 ku，等電點為5.98。且FAS蛋白具有2個特有的結構域，分別為PKS_ER 結構域和PKS_KR結構域，這2個結構域在生物脂肪酸合成過程中起關鍵性作用。此外，通過構建FAS基因系統發育樹，發現赤點石斑魚與大黃魚、軍曹魚親緣關系更接近，與人和小鼠的親緣關系最遠，而與原雞、熱帶爪蟾在FAS基因進化上比哺乳類有更近的親緣關系。該結果不僅支持了硬骨魚類的單系起源，也顯示脊椎動物從水生到陸生的進化軌跡，反映了物種間的進化關系。

該研究通過RT-PCR擴增發現赤點石斑魚FAS基因在腦、腸、脾、腹肌、肝臟、鰓、心臟、胃、背肌等組織中均有表達，且在心臟中表達量最高，其次是在肝臟中。FAS基因的表達直接影響脂肪酸合成酶的多寡，對魚體內脂肪酸的合成具有極大影響。關于脂肪酸合成部位，研究表明，脂肪酸的合成部位在不同物種中具有差異性，哺乳動物主要在脂肪組織中合成脂肪酸，而家禽脂肪酸合成部位主要在肝臟，由肝臟合成的脂肪酸約占總量的90%[24]。研究發現，不同魚類在不同組織中FAS基因mRNA表達量不同，瓦氏黃顙魚 (Pelteobaggrus vachelli) 在腸道中表達量最高，且顯著高于其他組織，肝臟組織中的表達量顯著高于肌肉、腦組織和腹腔脂肪組織[25]；匙吻鱘 (Polyodon spathula)在肝臟中表達量最高，其次是在腹腔脂肪中，在胃中表達量最低；而鳙 (Aristichthysnobilis) 在咽器官表達量最高，其次在腸道組織中，在鰓中表達量最低[26]。研究發現，吉富羅非魚肝臟中FASmRNA的表達豐度高于肌肉,且飼料脂肪水平能夠抑制FASmRNA表達,脂肪水平越高抑制作用越明顯[27]。由于個體差異，不同物種在不同生長條件下，各個組織中FAS基因mRNA表達量不同。該研究對赤點石斑魚不同組織中FAS基因不同表達量的探索，對脂肪酸合成調控研究具有一定的現實意義，通過對組織中脂肪酸合成酶量的調節，可以有效地控制魚體內脂肪的沉積，從而提高魚肉品質。因此，對FAS基因mRNA表達的時空性及不同條件下的表達調控需要在今后研究中進一步探索。

隨著分子生物學技術的出現和不斷成熟，人們從分子生物學水平對脂肪代謝的調控進行了一定探索性的研究。而該研究獲得的赤點石斑魚FAS基因全長序列，為進一步對赤點石斑魚脂肪相關的研究以及育種提供了理論基礎，同時也為今后研究赤點石斑魚與鱸魚目等近緣物種間分子進化和遺傳分化奠定理論基礎。

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Cloning and Sequence Analysis of FAS Gene in Epinephelus akaara

CHEN Si-yu,ZHANG Rui,YANG Yun-xia*

(College of Fishery,Zhejiang Ocean University,Zhoushan,Zhejiang 316022)

[Objective]To research the structure and expression characteristics of FAS (Fatty Acid Synthase) gene in Epinephelus akaara.[Method]With the transcriptome sequence obtained in previous research as the database,PCR technology was used to obtain the cDNA sequence of FAS gene in E.akaara.[Result]This sequence had high similarity with that of Larimichthy scrocea (87%).The total length of FAS gene was 8 505 bp,which included 712 bp 3′UTR,7 548 bp open reading frame (ORF),and 245 bp 5′UTR.A total of 2 515 amino acids were encoded.The protein molecular weight was 274.03 ku,isoelectric point was 5.98,and it belonged to the hydrophilic protein.Results of Real-time PCR showed that FAS gene had the highest expression in heart,followed with liver.Evolution of FAS gene was in accord with that of species.[Conclusion]This research lays theoretical basis for the fat metabolism of E.akaara,and provides basic data for the cultivation of E.akaara.

Epinephelus akaara;FAS gene;Tissue distribution

浙江省大學生科技創新活動計劃暨新苗人才計劃項目(2016R411016)；浙江海洋學院科研啟動經費項目(Q1418)；浙江海洋大學大學生科技創新項目(xj201512)。

陳斯鈺(1995- )，女，浙江紹興人，本科生，專業：水產養殖。*通訊作者，講師，博士，從事動物分子營養研究。

2016-07-08

S 965.334

A

0517-6611(2016)25-109-03