HPLC-MS法測定豬肉中地西泮等5種禁用藥物的殘留量

張倩勉

(廣西-東盟食品藥品安全檢驗檢測中心，廣西南寧 530021 )

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HPLC-MS法測定豬肉中地西泮等5種禁用藥物的殘留量

張倩勉

(廣西-東盟食品藥品安全檢驗檢測中心，廣西南寧 530021 )

[目的]建立快速、準確、高靈敏度的測定豬肉中地西泮等5種禁用藥物殘留量的分析方法。[方法]采用高效液相色譜-串聯質譜聯用法(HPLC-MS)，通過不同的離子模式進行豬肉中5種禁用藥物殘留量的測定，其中地西泮、丙酸睪酮、氯丙嗪采用正離子模式，玉米赤霉醇以及己烯雌酚采用負離子模式，并進行多反應檢測(MRM)。[結果]試驗顯示，該方法的線性范圍為：3～100 ng/mL，標準曲線線性良好，其回歸方程及相關系數分別為地西泮：Y=27 200X-0.009 31，R=1.000 0；丙酸睪酮：Y=13 800X-0.000 147，R=1.000 0；氯丙嗪：Y=0.095 1X+0.025 7，R=0.999 9；玉米赤霉醇：Y=44 100X-0.006 58，R=1.000 0；己烯雌酚：Y=0.093 4X+0.018 8，R=0.998 9。回收率分別為：地西泮100.50%～111.30%；丙酸睪酮73.30%～84.20%；氯丙嗪70.30%～99.10%；玉米赤霉醇69.90%～75.30%；己烯雌酚84.70%～117.70%。最低檢出限分別為：地西泮0.4 μg/kg，丙酸睪酮0.6 μg/kg，氯丙嗪0.3 μg/kg，玉米赤霉醇0.5 μg/kg，己烯雌酚0.8 μg/kg。[結論]該方法操作簡便、快速，是動物源性食品中地西泮等5種禁用藥物殘留的快速而準確的檢測方法。

高效液相色譜-串聯質譜聯用；豬肉；禁用藥物；殘留量；測定

地西泮是一種中樞神經系統鎮靜劑，主要用于人和動物鎮靜、催眠及癲癇的治療，添加到飼料里可提高動物的生長速度，因此在畜牧業生產中多作為動物生長促進劑。地西泮具有蓄積毒性，當人體長期攝入含有地西泮及其代謝物殘留的食物后，肝臟負擔加重，頭腦昏沉，記憶受損，個別人出現皮疹、白細胞減少及運動神經和肌肉功能受到抑制等種種不良反應，進一步危害到人類的食品安全與身體健康。丙酸睪酮作為一種人工合成的睪酮衍生物，是一種甾類蛋白質同化激素，因其具有提高飼料轉化率、促進動物生長、提高產量等作用而被用于水產養殖行業，然而水產品中殘留的丙酸睪酮對人體健康存在影響生長發育等很多危害，甚至有潛在的致癌性[1]。氯丙嗪是吩噻嗪類代表藥物，為中樞多巴胺受體的阻斷劑，作用于中樞神經系統[2]，常被用作催眠、鎮靜劑，在運輸過程中使用可以明顯減少動物的死亡率[3]，主要在肝臟代謝，易產生藥物殘留，對人們的身體健康造成很大影響[4]。玉米赤霉醇類化合物屬于同化激素的一種，有促進細胞的生長與分化、擴增肌肉、增強骨強度等作用，常被用于畜牧業養殖中，以促進動物生長。玉米赤霉醇有激素作用，通過食物鏈被人體吸收后，會引起心血管、肝、生殖系統、免疫系統等方面的病變甚至腫瘤。己烯雌酚是一種人工合成的雌激素，它能促進蛋白質的合成代謝，在養殖業中被用來提高動物日增重和飼料效率，促進禽畜生長。但由于其能引發動物和人的癌癥，甚至妊娠期間用藥或食用高含量己烯雌酚的食物還會殃及下一代[5]。

以上藥物在我國均已禁止在動物飼養中使用，不得在食品中檢出，但仍有一些不法飼養業主受利益驅使而違法使用。因此，研究和開發動物源性食品中禁用藥物殘留量的檢測技術，對于保護食品安全具有重要意義[6]。

1　材料與方法

1.1材料豬肉，市購；地西泮對照品(含量99.9%)、丙酸睪酮對照品(含量98.0%)、鹽酸氯丙嗪對照品(含量99.7%)、氯丙嗪-D6(含量99.7%)，中檢院；玉米赤霉醇(含量99%)，己烯雌酚(含量99.5%)；己二烯雌酚- D8(含量98%)；乙酸、甲醇均為色譜純；水為超純水。

主要儀器設備：安捷倫-1260高效液相色譜-4500 QTRAP質譜儀，美國AB公司；XSE205DU分析天平。

1.2方法

1.2.1對照品儲備液。準確稱取地西泮、丙酸睪酮、鹽酸氯丙嗪、玉米赤霉醇、己烯雌酚5種對照品，分別置5個10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得地西泮等5種對照品儲備液。濃度分別為1.075 0、1.020 0、0.976 6、0.729 0、1.067 0 mg/mL。

1.2.2混合對照品工作液。精密量取地西泮、丙酸睪酮、鹽酸氯丙嗪、玉米赤霉醇、己烯雌酚5種對照品儲備液各0.1 mL，置同一100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻(濃度分別為1.075 0、1.020 0、0.976 6、0.729 0、1.067 0 μg/mL)。

1.2.3內標儲備液的制備。精密稱取鹽酸氯丙嗪-D6 10.24 mg、己烯雌二酚-D8 1 mL(100 μg/mL)內標分別置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。

1.2.4混合內標工作液的制備。精密吸取鹽酸氯丙嗪內標儲備液0.02 mL、己烯雌二酚-D8內標儲備液2 mL置100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得，混合內標工作液約為200 ng/mL。

1.2.5標準曲線。分別吸取上述5種混合對照品工作液0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mL，置10 mL量瓶中，再分別加入1 mL混合內標工作液，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得標準曲線。

1.2.6色譜條件。色譜柱：Agilent SB-aq 4.6 mm×100 mm，2.7 μm；流動相組成：正離子模式中A為含0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸-甲醇溶液；負離子模式中C為水，D為乙腈；流速：0.4 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量10 μL。梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1　流動相洗脫程序

1.2.7質譜條件。

1.2.7.1正離子模式。離子源：電噴霧離子源；檢測方式為多反應監測( MRM)；氣簾氣流速：35 L/min；離子源溫度：650 ℃；碰撞氣流速：6 L/min；噴霧電壓：5 500 V；輔助氣流速：50 L/min；其余質譜條件見表2。

1.2.7.2負離子模式。離子源：電噴霧離子源；檢測方式：MRM；氣簾氣流速：35 L/min；離子源溫度：550 ℃；碰撞氣流速：6 L/min；噴霧電壓：-4 500 V；輔助氣流速：50 L/min；其余質譜條件見表2。

表2　地西泮等5種禁用藥物殘留量檢測的質譜條件

1.2.8樣品處理。

1.2.8.1供試品溶液制備。取該品2 g，置50 mL離心管中，加入0.2 mL內標工作液，8 mL乙酸銨緩沖液，高速均質30 s，加入30 μL β-葡萄苷醛苷酶-芳基硫酸酯酶，渦旋混勻30 s，37 ℃振蕩12 h。取出樣品靜置，使其溫度降至室溫。加入15 mL 3%氨水-乙腈溶液，5.0 g無水硫酸鈉，渦旋1 min后，在4 ℃、9 500 r/min離心5 min，收集上清液于另一50 mL離心管。剩余部分重新加入15 mL 3%氨水-乙腈溶液，旋緊螺旋蓋，室溫下平置于水平振蕩器，振蕩提取10 min，在4 ℃、9 500 r/min離心5 min，吸取上清液層溶液，合并2次提取有機相，待凈化。

一次性全部將QuEChERS吸附劑(100 mgPSA+40 mg C18+600 mg無水硫酸鎂)加入樣品提取液中，旋緊螺旋蓋，高速螺旋1 min，在4 ℃、9 500 r/min離心5 min。吸取所有有機相溶液，在減壓旋轉蒸發裝置上于42 ℃蒸發至近干。加入2 mL的10%乙腈-水溶液溶解殘渣，渦旋混合1 min，過0.22 μm濾膜。濾液供液相色譜-質譜儀測定。

1.2.8.2加標回收率試驗。稱取空白樣品2 g，9份，分成2組，1～3份為第1組，4～9份為第2組。在第1組中，分別加入0.2 mL曲線5溶液以及0.2 mL混合內標工作液，第2組中分別加入1 mL曲線5溶液以及0.2 mL混合內標工作液，從“8 mL乙酸銨緩沖液”起，其余步驟同供試品溶液的制備。

1.2.8.3檢出限溶液制備。稱取空白樣品2 g，置50 mL離心管中，加入0.1 mL曲線5溶液以及0.2 mL混合內標工作液，從“8 mL乙酸銨緩沖液”起，其余步驟同供試品溶液的制備。

1.2.8.4樣品測定方法。將處理好的待測液放入自動進樣器的樣品盤上，進樣器自動進樣10 μL，數據采集采用Analyst Software工作站進行采集處理，采用Quantitative Analysis軟件進行數據處理，使用外標法進行數據分析，得出樣品溶液中各種分析物的質量濃度。再根據以下公式得出檢測結果。結果計算用公式(1)，回收率計算用公式(2)，檢出限計算用公式(3)：

W=C×V/M

(1)

回收率(%)=測得量×100/加標量

(2)

檢出限(μg/kg)=進樣濃度×稀釋倍數×3/取樣量/信噪比

(3)

式中，W為樣品中各分析成分的含量(μg/kg)；C為測得濃度(ng/mL)；V為稀釋倍數；M為樣品取樣量(g)。

2　結果與分析

2.1質譜與色譜條件的選擇將含有1 μg/mL的各種分析物的對照品混合溶液在正離子和負離子模式下進行全掃描，找到最佳的電離模式。結果顯示，地西泮、丙酸睪丸、氯丙嗪在正離子模式下響應較強，玉米赤霉醇和己烯雌酚在負離子模式下響應較強，再分別在正離子和負離子模式下，進行碰撞能量的優化。在同一分析物中，以響應高的離子對作為定量離子。質譜條件見表2。不同模式下，采用不同的流動相，并采用梯度洗脫，使目標化合物能更好地與其他干擾物質分離，結果見圖1、圖2。

圖1　正離子模式下各化合物的圖譜Fig.1　The map of three compounds in positive ion mode

圖2　負離子模式下各化合物的分離情況Fig.2　Isolation of chemical compounds in positive ion mode

2.2線性關系將標準品曲線注入液相質譜聯用儀，以峰面積為(Y)軸，相對質量濃度為(X)軸建立標準曲線，并求出回歸方程，結果見表3。結果顯示，該方法的線性范圍為3～100 ng/mL，標準曲線線性良好，其回歸方程及相關系數見表3。

2.3回收率及精密度結果回收率試驗結果表明，添加不同濃度的各分析物，地西泮回收率在100.50%～111.30%，RSD值為1.22%～6.67%；丙酸睪酮回收率在73.30%～84.20%，RSD值為5.28%～5.52%；氯丙嗪回收率在70.30%～99.10%，RSD值為2.01%～2.60%；玉米赤霉醇回收率在69.90%～75.30%，RSD值為3.10%～4.40%；己烯雌酚回收率在84.70%～117.70%，RSD值為2.57%～3.84%。結果見表4。

表3各分析成分線性關系和相關系數

Table 3Linear relationship and correlation coefficient of the analysis components

化合物Chemicalcompound線性方程Linearequation相關系數Correlationcoefficient(R)地西泮DiazepamY=27200X-0.0093101.0000丙酸睪酮TestosteronepropionateY=13800X-0.0001471.0000氯丙嗪ChlorpromazineY=0.0951X+0.0257000.9999玉米赤霉醇ZeranolY=44100X-0.0065801.0000己烯雌酚DiethylstilbestrolY=0.0934X+0.0188000.9989

表4　各成分的回收率及精密度結果

接下表

續表1

2.4樣品檢測結果及方法檢出限按照試驗方法對樣品進行前處理，然后進樣分析。地西泮、丙酸睪酮、氯丙嗪采用正離子模式，玉米赤霉醇以及己烯雌酚采用負離子模式，根據標準曲線，氯丙嗪及己烯雌酚通過內標法，其他化合物通過外標法對結果進行計算，結果顯示，所檢測的豬肉樣品中，未檢出地西泮等5種禁用藥物。同時，在該試驗條件下，在空白樣品中添加標準溶液進行測定，以質譜儀3倍信噪比計算目標物組分的檢出限，結果見表5。

表5　各化合物的檢出限結果

3　結論

該試驗建立的豬肉中地西泮等5種禁用藥物殘留量的分析方法，地西泮、丙酸睪酮、氯丙嗪在正離子模式下響應高，而玉米赤霉醇以及己烯雌酚在負離子模式下響應高，通過同時采用正負離子模式進行多反應監測，能很好地將豬肉中5種禁用藥物分離出來。結果顯示，標準曲線線性良好，回收率高，檢出限低。該方法操作簡便、快速，是動物源性食品中地西泮等5種禁用藥物殘留的快速而準確的檢測方法。

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Determination of Diazepam and Other Four Kinds of Banned Drugs in Pork by HPLC-MS

ZHANG Qian-mian

(Guangxi and Asean Inspection Testing Center For Food and Drug Safety,Nanning,Guangxi 530021)

[Objective]To establish a rapid,accurate,highly sensitive determination method for diazepam and other four kinds of banned drugs in the pork.[Method]High performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry (HPLC-MS) was used with different ion modes.Residual quantities of five banned drugs in pork were detected.Among them,positive ion mode was used for diazepam,testosterone propionate and chlorpromazine;while negative ion mode was used for zearalanol and diethylstilbestrol.[Result]The linear range of this method was 3-100 ng/mL;the standard curve had good linearity.Their regression equations and R values were as follows: diazepam: Y=27 200X-0.009 31 and R=1.000 0,respectively.Testosterone propionate: Y=13 800X-0.000 147,R=1.000 0;chlorpromazine: Y=0.095 1X+0.025 7,R=0.999 9;zearalanol: Y=441 00X-0.006 58,R=1.000 0;diethylstilbestrol: Y=0.093 4X+0.018 8,R=0.998 9.Recovery rates were: 100.50%-111.30% for diazepam,73.30%-84.20% for testosterone propionate,70.30%-99.10% for chlorpromazine.69.90%-75.30% for zearalanol,84.70%-117.70% for diethylstilbestrol.The minimum detection limits were: 0.4 μg/kg for diazepam,0.6 μg/kg for testosterone propionate,0.3 μg/kg for chlorpromazine,0.5 μg/kg for zearalanol,and 0.8 μg/kg for diethylstilbestrol.[Conclusion]This method is rapid,simple,sensitive and accurate,and it is a suitable method for rapid determination of diazepam and other four kinds of banned drugs in the animal derived food.

HPLC-MS;Pork;Banned drugs;Residues;Determination

張倩勉(1981- )，女，廣西北海人，工程師，碩士，從事食品安全檢測研究。

2016-07-11

S 851.34+7

A

0517-6611(2016)25-071-05