自制酸菜中植物乳桿菌的分離與鑒定

程秀玉，王炎松

(1.海南省疾病預防控制中心，海南海口 570203；2.海口維瑅璦生物研究院，海南海口 570312)

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自制酸菜中植物乳桿菌的分離與鑒定

程秀玉1，王炎松2

(1.海南省疾病預防控制中心，海南海口 570203；2.海口維瑅璦生物研究院，海南海口 570312)

[目的]了解自制酸菜中的有益菌種，為分析其營養價值提供依據。[方法]采用涂布分離和燭缸厭氧法對自制酸菜中的有益菌種進行培養，并對得到的細菌菌落形態特征及生化特征進行分析。[結果]經篩選，得到3株乳酸桿菌，其中2株為植物乳桿菌，1株為短乳桿菌。[結論]自制酸菜中含有多種植物乳酸桿菌，具有較高的營養價值。

自制酸菜；植物乳桿菌；分離與鑒定

乳酸菌是指一群通過發酵糖類，產生大量乳酸的細菌總稱，是一類革蘭氏染色陽性的厭氧性細菌。由于乳酸菌本身的生理特性，在發酵食品行業中常作為發酵劑以改善食品的風味和質地等。植物乳桿菌是一種有益乳酸菌，能對食品產生獨特的風味，在人體內具有維持腸道內菌平衡、降低膽固醇[1]、提高人體免疫和促進營養物質吸收等多種功能。因此，植物乳桿菌被廣泛應用于多種領域中。筆者采用涂布分離和燭缸厭氧法對自制酸菜中的有益菌種進行培養，并對得到的細菌菌落形態特征及生化特性進行分析。

1　材料與方法

1.1材料自制酸菜，MRS培養基：蛋白胨10.0 g，牛肉粉5.0 g，酵母粉4.0 g ，葡萄糖20.0 g，吐溫80 1.0 mL，K2HPO4·7H2O 2.0 g，醋酸鈉·3H2O 5.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·4H2O 0.05 g，瓊脂粉15.0 g，pH調節為6.2。細菌生化微量鑒定管來源于杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2主要儀器生物顯微鏡、培養箱、恒溫干燥箱、電子分析天平、超凈臺、培養皿、錐形瓶、玻璃棒、接種環、接種針、酒精燈、載玻片、無菌試管、移液器。

1.3方法

1.3.1酸菜的制作[2]。選用新鮮成熟的大芥菜，去除頭部、根部，清水洗凈后晾干，切成小塊，放入酸菜壇，壓實，加適量黃酒、食醋等調料，再注入濃度3%左右的鹽水，至離壇口約2 cm處，用壇蓋密封發酵，室溫18 ℃左右，發酵時間5 d，發酵成熟后及時用于試驗。

1.3.2菌落培養與鑒定。

1.3.2.1涂布分離。以無菌操作將經過充分搖勻的25 g檢樣放入裝有225 mL滅菌生理鹽水的滅菌錐形瓶內制成10-1的均勻稀釋液。

用1 mL無菌吸管吸取10-1稀釋液1 mL，沿管壁緩慢注入裝有9 mL滅菌生理鹽水的試管中，將試管中的液體混合振蕩均勻。

另吸取1 mL無菌吸管按上述操作順序，配制10倍遞增稀釋勻液，每遞增稀釋液1次，即換1支1 mL滅菌吸管，這樣按10倍遞增將稀釋液稀釋至10-4、10-5、10-6。

選擇10-4、10-5、10-6稀釋液，每個稀釋度吸取0.1 mL樣品勻液分別涂布于MRS培養基的平皿，并作好標記。采用燭缸厭氧法37 ℃培養48 h。

作空白對照，吸取0.1 mL生理鹽水分別涂布于同一批MRS培養基平皿中。

1.3.2.2初篩。在超凈工作臺上將各平板中具有乳酸菌菌落特征的菌落進行多次劃線分離，直到分離到疑為乳酸菌的單菌落，再將單菌落進行純培養，留待下一步檢測鑒定。

1.3.2.3鑒定。①革蘭氏染色。將培養好的菌種，刮取菌苔，先進行革蘭氏染色，革蘭氏染色為陽性的，留待下一步檢測。②過氧化氫酶試驗。用接種環挑取菌落，置于潔凈試管內，滴加3%過氧化氫溶液2 mL，觀察結果，有氣泡的為陽性，無氣泡的為陰性。試驗菌為陰性的，并且鏡檢為桿菌的，則可留待下一步試驗。③葡萄糖發酵產酸試驗。用接種針挑取菌種接入放有葡萄糖發酵培養基的葡萄發酵管中，37 ℃培養24 h，若溶液變渾濁，說明產酸，為陽性，否則為陰性[3]。④明膠液化試驗。用接種針挑取菌落穿刺于明膠中，37 ℃培養7 d，然后置于冰箱中0.3～1.0 h，若不再凝固，說明此菌已液化明膠，不是乳酸菌，不液化明膠的則為乳酸菌。⑤淀粉水解試驗。將菌種接種于淀粉生化管中，37 ℃培養24 h后，在生化管中滴加革蘭氏碘液，觀察顏色變化。若呈藍黑色或藍紫色，表示未水解或不完全水解淀粉酶，顯陰性；若不顯色表示不水解淀粉酶，顯陽性。⑥碳水化合物糖醇發酵試驗。將菌種分別接種于各生化管中，37 ℃培養24 h，觀察顏色變化。⑦動力試驗。用接種針挑取菌落穿刺于半固體瓊脂培養基中，37 ℃培養48 h，然后觀察。若培養物只生長在接種的穿刺線上，邊緣十分清晰，說明試驗菌無運動性；若培養物生長由穿刺線向四周呈云霧狀擴散，其邊緣模糊呈云霧狀，表示試驗菌有運動性[3]，則為植物乳桿菌。

2結果與分析

2.1篩選結果從平皿培養基挑取單菌培養菌種，根據乳桿菌及植物乳桿菌的形態特征，將各菌種進行革蘭氏染色為陽性，過氧化氫酶陰性，鏡檢為桿狀形的，共選出3株菌，標記為L1、L2、L3。

2.2鑒定結果對3株菌種的細菌形態特征、菌落形態特征和生化反應特征進行鑒定，結果見表1、2。

根據菌種的細菌形態、菌落形態特征和生化反應特征，依據《伯杰細菌手冊》(第8版)[4]、《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[3]和GB 4789.35—2010《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》[5]，鑒定L1和L2為植物乳桿菌，L3為短乳桿菌。

表1酸菜中分離得到的乳酸菌及菌落形態特征

Table 1The morphological characters of the lactic acid bacteria and colony isolated from pickle

菌株Strains細菌形態Bacterialmorphology菌落形態ColonymorphologyL1圓端直桿狀,兩端圓形,革蘭氏染色陽性,無芽孢,無鞭毛,單個或成短鏈狀存在,能運動白色,中央凸起,表面光滑,圓形,邊緣整齊,有光澤L2圓端直桿狀,兩端圓形,革蘭氏染色陽性,無芽孢,無鞭毛,單個或成短鏈狀存在,能運動白色,中央凸起,表面光滑,圓形,邊緣整齊,有光澤L3圓端短桿狀,革蘭氏染色陽性,成對或成鏈存在,無芽孢,無鞭毛,不運動乳白微黃,低凸,表面光滑,邊緣整齊,有光澤

表2　從酸菜中分離得到的乳酸菌生化特征

注：“+”表示90%以上菌株陽性；“-”表示90%以上菌株陰性；“d”表示11%～89%菌株陽性。

Note：“+”stands for more than 90% of the strains were positive;“-”stands for more than 90% of the strains were negative;“d”stands for 11%-89% of the stains were positive.

3　結論

試驗結果表明，自制酸菜中是含有植物乳桿菌的，說明酸菜具有較高的營養價值，加上其口感清爽又開胃，因此可將從酸菜中分離純化得到的有益乳酸菌，應用到食品、農業和醫藥等行業中，對提高人民健康水平起到積極意義。

[1]李常營，盧曉霆，于志會，等.酸菜來源植物乳桿菌S4-5的降膽固醇作用[J].食品科學，2011，32(7)：69-72.

[2]李文斌，唐中偉，宋敏麗，等.農家泡菜發酵液中乳酸菌的研究[J].食品工程，2009(3)：38-41.

[3]凌代文.乳酸細菌分類鑒定及實驗方法[M].北京：中國輕工業出版社，1999.

[4]布坎南R E，吉本斯N E.伯杰細菌鑒定手冊[M].8版.北京：科學出版社，1984.

[5]中華人民共和國衛生部.食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗：GB 4789.35—2010[S].北京：中國標準出版社，2010.

Isolation and Identification of Lactobacillus plantarum in Homemade Pickle

CHENG Xiu-yu1,WANG Yan-song2

(1.Hainan Provincial Center for Disease Control and Prevention,Haikou,Hainan 570203;2.Haikou VTI Biological Institute,Haikou,Hainan 570312)

[Objective]The aim was to understand the beneficial bacteria in homemade pickle,and provide a basis for analysis of its nutritional value.[Method]The beneficial bacteria in homemade pickle were cultured by spread plate method and candle jar anaerobic method,the morphological characteristics and biochemical characteristics of obtained bacterial colony were analyzed.[Result]3 strains of lactic acid bacteria were screened successfully,including 2 strains of Lactobacillus plantarum and 1 strain of Lactobacillus brevis.[Conclusion]Homemade pickle contains a variety of Lactobacillus plantarum,which has the high nutritive value.

Homemade pickle;Lactobacillus plantarum;Isolation and identification

程秀玉(1979- )，女，海南海口人，食品工程師，從事食品研究。

2016-07-13

TS 201.3

A

0517-6611(2016)25-039-02