RNAi沉默CXCR6基因對肺癌A549細胞增殖、體外侵襲力和裸鼠成瘤能力的影響

周慧芬　王定淼　李勇湖北科技學院基礎醫學院病理教研室，湖北　咸寧　43700咸寧市中心醫院重癥醫學科，湖北　咸寧　43700

3咸寧市衛生服務中心，湖北　咸寧　437100

RNAi沉默CXCR6基因對肺癌A549細胞增殖、體外侵襲力和裸鼠成瘤能力的影響

周慧芬1王定淼2李勇3#
1湖北科技學院基礎醫學院病理教研室，湖北咸寧4371002咸寧市中心醫院重癥醫學科，湖北咸寧437100

3咸寧市衛生服務中心，湖北咸寧437100

目的探討RNAi沉默CXC型趨化因子受體6（CXCR6）基因對A549細胞增殖、體外侵襲力和裸鼠成瘤能力的影響。方法MTT法和Transwell小室模型檢測穩定沉默CXCR6基因的A549細胞增殖和細胞侵襲遷移能力。將穩定沉默CXCR6的A549細胞與正常A549細胞分別皮下接種裸鼠，觀察接種后腫瘤生長情況。結果穩定沉默CXCR6基因的A549細胞與正常A549細胞相比，前者增殖速率下降（P＜0.05），平均增殖抑制率為30.70%；前者的體外侵襲力也降低（P＜0.05），平均侵襲抑制率為74.93%，平均遷移抑制率為70.19%。裸鼠體內實驗顯示，穩定沉默CXCR6基因的A549細胞與正常A549細胞相比，其裸鼠體內成瘤能力降低（P＜0.05），瘤體重量下降了62.5%。結論RNAi沉默CXCR6基因，可以抑制A549細胞的增殖、體外侵襲力和成瘤能力。

RNAi干擾；CXCR6基因；肺癌；增殖；侵襲力

Oncol Prog，2016，14（4）

肺癌是全球發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。雖然肺癌的多學科綜合治療水平已經得到較大提高，但5年生存率只有15%左右［1］。據研究報道，應用RNAi技術沉默CXCR4可明顯抑制腫瘤細胞的轉移［2-3］。但是，RNAi技術應用于CXC型趨化因子受體6（CXC chemokine receptor，CXCR6）基因還沒有文獻報道過。因此，我們應用RNAi技術特異性沉默CXCR6基因，降低CXCR6的表達，觀察是否能抑制肺癌細胞的增殖、侵襲及遷移［3-4］。目前，CXCR6基因在腫瘤尤其在肺癌中的作用機制尚未明確，使用RNAi技術干擾CXCR6基因表達，觀察對肺癌細胞的影響，可為腫瘤的治療提供依據。本研究采用RNAi技術靶向沉默CXCR6基因，探討其對肺癌A549細胞增殖、體外侵襲力和裸鼠成瘤能力的影響。

1　材料與方法

1.1實驗材料

人肺腺癌細胞系A549由上海大學基礎醫學部免疫學實驗室提供。

靶向CXCR6基因的shRNA表達質粒由上海吉凱公司合成，引物及其序列見下：

噻唑藍（MTT）為北京普利萊基因技術有限公司產品；24孔培養板、96孔培養板為Corning公司產品；Transwell板為Corning公司產品；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）為Sigma公司產品；4%多聚甲醛溶液購自北京賽馳生物有限公司；蘇木素染色液為碧云天產品；稀鹽酸、75%乙醇和PBS緩沖液、1m l注射器、刻度標尺由實驗室自行配置。

BALB/C裸鼠，雄性，4～6周齡，（18±2）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司［SCXK（湘）2011-0003］，SFP級環境飼養。

1.2實驗方法

1.2.1脂質體法CXCR6-shRNA轉染A549細胞及構建穩定轉染A549細胞株把培養瓶內細胞生長處于對數期的A549細胞消化下來，以2×105/孔數目接種于6孔細胞培養板內，各孔放入2 m l完全培養基。當細胞融合率達到70%左右，用脂質體lipofectam ine 2000轉染細胞。將細胞分為實驗組（phU6/GFP/Neo-CXCR6）、陰性對照組（phU6/GFP/ Neo）和空白對照組（Mock），分別轉染phU6/GFP/ Neo-CXCR6、phU6/GFP/Neo-NC及脂質體。按每個孔有l×105/孔細胞種24孔細胞培養板，等待細胞貼壁以后將0、100、200、400、800、1000 μg/μl這6個濃度分別加入對應的G418體積數。然后，每天觀察細胞的死亡狀況，當所有的細胞死亡時最低的G418濃度就可以確定為最終的穩篩細胞濃度。在轉染后第二天將細胞消化下來，稀釋接種24 h后加入G418試劑進行篩選，初始質量濃度為800 μg/m l，當有大量細胞死亡時，將G418濃度減半維持篩選，篩選2周后，可見有抗性克隆出現，通過熒光監測有效轉染克隆情況，挑選陽性克隆轉入24孔板擴大培養，直至擴增至25 cm2的培養瓶體系，同時將G418濃度改為200 μg/m l繼續維持篩選。

1.2.2用MTT法檢測細胞增殖實驗分為3組：未轉染對照組（Blank-control）、phU6/GFP/Neo-control組（shRNA-control）和phU6/GFP/Neo-CXCR6組（CXCR6-shRNA）。每組每個時間點設5個復孔，將細胞以2×103/孔的密度種植于96孔板，37℃培養24 h后每孔每100 μl培養基加入10 μl MTT stock（5 mg/m l），37℃培養箱內繼續孵育4 h。4 h后吸出孔內液體，各個孔內放入100 μl DMSO，振蕩培養板，10 m in后用酶標機測定570 nm處的光吸收度OD值。

1.2.3Transwell膜侵襲實驗檢測A549細胞侵襲遷移能力的影響實驗也分為3組：正常對照組組、陰性對照組和干擾組。在24孔板每孔內加入含10%FBS 600 μl RPM I 1640培養液。收集生長處于對數期的各組細胞，將其重新懸浮于無血清培養基內，調成使用濃度為l×105/m l。將細胞懸液加入Transwell小室上室中，每孔100 μl，將小室浸于24孔板的條件培養基中，37℃5%CO2培養箱內孵育20 h。將Transwell小室取出，PBS洗滌小室上、下部2次，4%多聚甲醛固定10 m in。PBS洗滌2次，蘇木素染色5 m in，稀鹽酸乙醇分色1 s，自來水迅速沖洗數秒，用棉簽輕擦掉上室未穿過膜的細胞；光學顯微鏡下觀察穿過細胞密度并拍照，且計數穿透細胞個數，每張濾過膜分別計算5個不同區域所穿出的細胞個數，計算出每組平均值。每組平行設3個濾膜。

侵襲指數=實驗組遷移至下表面的細胞數/對照組遷移至下表面的細胞數。

1.2.4沉默CXCR6基因對人肺癌A549細胞裸鼠成瘤的影響［5-6］將購買的裸鼠先放置在獨立送風隔離籠具中飼養1周以適應新的環境，在適宜溫度、適宜濕度、自然光晝夜照射及SPF級條件下進行飼養，提前將鼠籠、鋸末墊料、飲用自來水和喂養的飼料都經過高壓蒸汽滅菌處理，每間隔3 d換掉舊的飼料、飲用自來水及鋸末墊料。實驗過程中嚴格遵守無菌操作原則。在37℃，5%CO2培養箱中培養細胞，當CXCR6-shRNA-（2819-1）A549細胞和未轉染對照組A549細胞長到2×105/m1密度后終止培養，對每組細胞分別經胰蛋白酶的適度消化，約3～4 m in后，倒掉消化液，然后用完全培養基終止消化，最后用細胞計數板計數，用無血清的RPM I 1640培養液調整細胞密度制成2×107/m1細胞懸液。分別收集細胞于1.5 m1 EP管中備用。將裸鼠隨機分為2組，實驗組接種CXCR6-shRNA-（2819-1）A549細胞；對照組接種A549細胞，每組15只。將裸鼠背部皮膚局部消毒后，用1 m l注射器吸取0.2 m l細胞懸液，接種于BALB/c鼠左側臀背交界處皮下約5×106/只。完成腫瘤細胞注射后，常規飼養裸鼠，連續觀察裸鼠成瘤情況，裸鼠長出腫瘤后，繼續觀察3周，并每周用刻度標尺測量腫瘤大小。觀察結束后處死裸鼠，剝離腫瘤，稱量瘤重，并解剖其他臟器觀察移植瘤有無轉移，最后繪制腫瘤體積變化曲線。將裸鼠斷椎處死取材后，立即用4%多聚甲醛溶液行標本固定，經酒精梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟，樣本包埋，切成厚約4 μm的薄片，脫蠟，依次經二甲苯、梯度酒精處理，蘇木素、伊紅染色（HE染色），再依次經梯度酒精、二甲苯處理，晾干，最后用中性樹膠封片。同時，參照相關文獻實驗方法對病理組織切片進行免疫組織化學染色［7-9］。

表1　沉默CXCR6表達抑制A549細胞的增殖

1.3統計學處理

應用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析，實驗數據以均數±標準差（±s）的方式表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2　結果

2.1MTT法分析沉默CXCR6表達抑制A549細胞的增殖

各個組分別設有5個復孔，每次檢測的實驗數值以OD值表示，結果見表1。經統計學分析，自第三天以后CXCR6-shRNA組較其他2個對照組的細胞增殖速率減緩，差異有統計學意義（P＜0.01）。第3～5天的增殖平均抑制率分別為33.19%、33.99%、24.92%。結果顯示，沉默CXCR6的A549細胞增殖率明顯下降。穩定轉染phU6/GFP/Neo-CXCR6質粒組（干擾組）3～5 d各時間點的OD值均低于穩定轉染phU6/GFP/Neo組（陰性對照組）和未轉染對照組（正常對照組）的OD值，差異有統計學意義（P＜0.01），而陰性對照組和正常對照組差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2沉默CXCR6表達抑制A549細胞的侵襲遷移結果

侵襲實驗在接種細胞24 h后，遷移實驗在接種細胞12 h后，分別用蘇木素染色結果，如圖1，侵襲及遷移至小室膜下表面的細胞計數結果（分別計數5個視野），詳見表2。經統計學分析，轉染CXCR6-shRNA組與其他2個對照組相比，侵襲及遷移至小室膜下表面的細胞數減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1　光鏡下各個組別細胞侵襲及遷移圖像（×100）

表2　侵襲及遷移至小室膜下表面的細胞數

2.3.1沉默CXCR6基因對兩組瘤體質量、體積的變化接種瘤細胞第15天，對照組1只裸鼠死于真菌感染，其余裸鼠生長狀態良好，肉眼未見瘤細胞長出。接種瘤細胞第20天，實驗組1只裸鼠死于皮膚潰爛，其余裸鼠生長狀態良好，但肉眼仍未見瘤細胞長出。接種瘤細胞第21天，對照組裸鼠臀背部長出大小為（0.2×0.3）～（0.3×0.4）cm2的瘤結節，實驗組裸鼠臀背部長出大小為（0.1×0.2）～（0.2×0.3）cm2的瘤結節，繼續觀察3周，每隔7 d觀察一次，并測量腫瘤的大小，觀察結果顯示實驗組裸鼠瘤體生長速度明顯比對照組慢，且體積比對照組小。接種第42天，將裸鼠處死，觀察成瘤情況：解剖肺臟、肝臟、腸及胸腹壁，肉眼未見此器官的遠處轉移。如表3所示，從解剖出的瘤體可以看出，對照組裸鼠瘤體積明顯比實驗組大。分別稱取兩組瘤體質量，比較其差別，實驗組瘤體質量低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3沉默CXCR6基因對人肺癌A549細胞裸鼠成瘤的影響

表3　兩組裸鼠的瘤體體積及質量

2.3.2種植瘤病理學特征分析對解剖出的裸鼠移植瘤組織進行HE染色后，結果顯示對照組的移植瘤組織有明顯的異型性，瘤細胞實質分布呈巢穴狀或者索條狀，間質內纖維組織較少，瘤細胞大小呈不均一性，胞核大而濃染，核仁明顯，可見病理性核分裂相，并可見多核細胞。實驗組瘤細胞實質也呈現巢穴狀或索條狀分布，腺泡樣結構可以在某一區域見到，間質的纖維組織比對照組多，瘤細胞和胞核較對照組小，可見核仁，極少見到有病理性核分裂相、多核細胞的分布（如圖2）。

2.3.3兩組種植瘤CXCR6表達差異分析人肺癌A549細胞表達CXCR6蛋白，陽性著色于癌細胞的胞質和胞膜。對解剖出的裸鼠移植瘤組織進行IHC染色后，結果顯示實驗組和對照組的癌細胞的胞質和胞膜均可觀察到明顯的棕褐色特異性染色（即陽性著色），但實驗組的癌細胞陽性著色部分明顯比對照組的少。詳見圖3。

圖2　裸鼠移植瘤組織病理切片在光學顯微鏡下的HE染色圖（×200）

圖3　裸鼠移植瘤組織病理切片在光學顯微鏡下的IHC染色圖（×200）

3　討論

肺癌是全球發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。雖然肺癌的多學科綜合治療水平已經得到了較大的提高，然而總體5年生存率只有15%左右，這就要求我們尋找新的方法，開辟新的治療途徑。趨化因子是新發現的一類細胞因子。它的主要作用是趨化細胞的遷移。趨化因子與趨化因子受體匹配后，不僅能夠在淋巴細胞募集、胚胎生長發育、血管新生、造血等生理狀況下起作用，而且能夠在動脈粥樣硬化性病變、炎癥性病變、良惡性腫瘤以及艾滋病等病理狀況下發揮重要作用。CXCL16/CXCR6就是一個具有這種獨特功能的趨化因子配體-受體對。CXCL16屬于趨化因子超家族成員之一，它具有cys-x-cys氨基酸（CXC）模序的特征，同時又具有cys-cys氨基酸（CC）家族和cys-x-3-cys氨基酸（CX3C）家族趨化因子的特征，它是由趨化結構域、糖基化黏蛋白樣柄結構域、單螺旋的跨膜結構域及胞漿結構域4個部分組成。它是以跨細胞膜型（TM-CXCL16）和可溶解型（sCXCL16）兩種形式存在的。膜整合素蛋白酶ADAM 10、ADAM 17對TM-CXCL16進行蛋白水解，趨化結構域從細胞表面脫落形成sCXCL16，行使趨化因子功能，產生的可溶性蛋白只有被活化巨噬細胞產生的ADAM-10或ADAM-17等蛋白酶作用才能清除。TM-CXCL16主要在APC細胞、腸濾泡相關性上皮細胞等免疫細胞膜表面高表達。CXCL16也被發現可異常表達于多種腫瘤細胞。CXCR6最初被稱為Bonzo、STRL33或TYMSTR，由人第3號染色體編碼，N端和細胞外第3環缺少半胱氨酸殘基。最初認為CXCR6主要表達于某些特定的免疫細胞亞群如效應T細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、NK細胞、NKT細胞、漿細胞等。隨著研究的不斷深入，現在發現一些腫瘤細胞也存在CXCR6的異常表達，如在鼻咽癌、神經膠質瘤、惡性黑色素瘤、部分結直腸癌等腫瘤細胞表面均檢測到CXCR6異常表達。

趨化因子受體CXCR6是CXCL16的唯一受體。CXCL16/CXCR6這一趨化因子配體受體對的相互作用會促進腫瘤血管生成，促進腫瘤增殖和轉移。我們前期研究發現，人前列腺癌細胞有CXCL16/CXCR6的異常表達，且外源性CXCL16可以明顯促進人前列腺癌細胞系的體外增殖活性和體外侵襲力。有研究也發現，CXCL16/CXCR6在人類肺癌組織中呈現高表達，它們也在人肺癌細胞系A549、95D及H292中異常表達，體外添加CXCL16可顯著增強A549、95D及H292細胞系的生長增殖活力以及侵襲能力，且這種外來性的CXCL16作為抗原分子能夠與CXCL16抗體結合產生中和反應，因而能成功地遏制CXCL16蛋白對3種肺癌細胞系產生的促進作用，這提示CXCL16/CXCR6這對趨化因子配體受體對的高表達與肺癌的浸潤、轉移密切相關［14］。新近發現這種趨化因子受體CXCR6在腫瘤的發生發展過程中可能起重要作用，進行此基因水平上的干預，將會有助于腫瘤的靶向治療。據研究報道，孫琳等［12］應用RNAi技術沉默CXCR4可明顯抑制腫瘤細胞的轉移。另有實驗表明，RNAi技術可抑制STAT3在人肺腺癌A549細胞中的表達，并抑制腫瘤細胞的生長，促進其凋亡［13］。本實驗使用RNAi技術沉默CXCR6基因，有效抑制該基因的表達，既然CXCR6對肺癌細胞的生長增殖和侵襲、轉移均有重要作用，那么沉默CXCR6基因將會抑制肺癌細胞的生長增殖和侵襲、轉移，這在本文實驗得到了進一步的驗證。從以上可以看出，CXCR6對肺癌細胞的增殖和侵襲轉移有重要作用，故本實驗使用RNAi技術沉默肺癌A549細胞中的CXCR6基因，抑制該基因的表達，觀察沉默CXCR6基因將對肺癌細胞生長增殖、侵襲和轉移的影響，并利用MTT法和Transwell小室模型法來研究CXCR6基因沉默后A549細胞的增殖和侵襲遷移能力的變化。實驗結果表明，轉染CXCR6-shRNA組與其他2個對照組相比，侵襲及遷移至小室膜下表面的細胞數減少，且差異有統計學意義（P＜0.05）；從侵襲及遷移的圖片結果來看，干擾組侵襲及遷移至小室膜下表面的細胞數比正常對照組和陰性對照組均減少。證明沉默CXCR6基因表達對A549肺癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力具有抑制作用。以上結果提示CXCR6基因有望成為預防和治療肺癌侵襲及轉移的潛在靶點之一。

綜上所述，穩定沉默CXCR6基因的A549細胞株增殖能力和侵襲遷移能力都明顯降低，沉默CXCR6基因能夠有效抑制肺癌裸鼠的成瘤能力。

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The effect of CXCR6 silencing by RNAi on proliferation，invasion ability and tumorigenicity in nude m ice of lung cancer cell line A 549

ZHOU Hui-fen1WANG Ding-m iao2LI Yong3#
1Department of Pathology，Hubei Science and Technology Institute of Basic Medical Sciences，Xianning 437100，Hubei，China
2Department of Intensive Care，Xianning Central Hospital，Xianning 437100，Hubei，China
3Xianning Health Service Center，Xianning 437100，Hubei，China

Objective To investigate the effect of CXCR6 gene silencing by RNAi on proliferation，invasion ability and tumorigenicity in nude m ice of lung cancer cell line A549.Method The proliferation，invasion and m igration ability of cell line A549 w ith CXCR6 knockdown were detected by MTT and Transwell assay.Meanwhile，the grow th of subcutaneously implanted tumors was observed in nude m ice after inoculated w ith A549 cells w ith CXCR6 knockdown and w ith the control normal cells of A549.Result Proliferation of A549 cells w ith CXCR6 knockdown was significantly suppressed compared w ith normal cells（P＜0.05），and the average rate of proliferation inhibition was 30.70%；CXCR6 knockdown also lowered the invasion ability（P＜0.05），w ith an average rate of invasion inhibition of 74.93%，and an average rate of m igration inhibition of 70.19%，respectively.In nude mice tests，the tumorigenicity of A549 cells was inhibited when CXCR6 was silenced（P＜0.05），and the tumor weight was reduced by 62.5%.Conclusion Silencing the expression of CXCR6 may inhibit the proliferation，in-vitro invasion ability as well as tumorigenicity of A549 cells.

RNA interference；CXCR6 gene；lung cancer；proliferation；invasiveness

R734.2

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.04.12

2015-07-14）

（corresponding author），郵箱：zhovhf@163.com