α-葡萄糖苷酶抑制劑和葡萄糖苷酶的作用機制研究

王文,王金虎，張小康，趙祥妤

(棗莊學院a.化學化工與材料科學學院；b.美術與藝術設計學院，山東棗莊　277160)

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α-葡萄糖苷酶抑制劑和葡萄糖苷酶的作用機制研究

王文a,王金虎a，張小康a，趙祥妤b

(棗莊學院a.化學化工與材料科學學院；b.美術與藝術設計學院，山東棗莊277160)

α-葡萄糖苷酶是水解碳水化合物的關鍵酶，抑制α-葡萄糖苷酶的活性能夠抑制餐后高血糖.α-葡萄糖苷酶抑制劑可以延緩腸道碳水化合物吸收,是一種比較成熟的治療糖尿病藥物.為了發現新的具有更好治療效果的α-葡萄糖苷酶抑制劑，對于α-葡萄糖苷酶抑制劑與α-葡萄糖苷酶的作用機制的研究變得尤為重要.本文主要采用分子對接的方法，研究了幾種α-葡萄糖苷酶抑制劑與α-葡萄糖苷酶的結合模式和作用機制，明確了可能的結合位點.同時，基于對接結構設計了兩種具有潛在活性的抑制劑分子，為實驗上α-葡萄糖苷酶抑制劑的研究提供了理論基礎.

糖尿病；葡萄糖苷酶；抑制劑；分子對接；活性位點①

0　引言

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種以高血糖為特征，由于脂肪和蛋白質代謝紊亂導致胰島素分泌不足或胰島素生物作用受限的代謝性疾病.高血糖則是由于胰島素分泌缺陷或其生物作用受損，或兩者兼有引起[1,2].糖尿病已被國家列為“新藥創制科技重大專項”的十大類重大疾病之一，研究開發新型糖尿病治療藥物迫在眉睫.

糖尿病的主要危害是高血糖導致多系統、多臟器并發癥的發生，多臟器并發癥是糖尿病引起死亡及殘疾的主要原因.血糖的主要來源是食物中的糖類，日內最大血糖波動和餐后血糖的波動是造成糖尿病患者血管內皮損傷的重要因素.碳水化合物經過α-葡萄糖苷酶催化水解后，只有生成單糖才能被吸收，而催化水解碳水化合物的α-葡萄糖苷酶主要分布于小腸黏膜上，其包含有蔗糖酶、乳糖酶、麥芽糖酶、α-淀粉酶和α-糊精酶等[3-6].

酶是指具有生物催化功能的高分子物質，在酶的催化反應體系中，反應物分子被稱為底物，底物通過酶的催化轉化為另一種分子.幾乎所有的細胞活動進程都需要酶的參與，以提高效率.酶在生命活動中發揮著重要作用，對身體代謝起到重要的調節作用.因此α-葡萄糖苷酶是調節食物來源血糖的關鍵酶，成為調控餐后血糖的作用靶酶，α-葡萄糖苷酶抑制劑是控制餐后血糖的對癥治療藥物.

1　數據收集

1.1抑制劑分子的獲取

本文中首相選的是目前臨床上主要應用的α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物：阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖，主要結構如圖1所示.

圖1　抑制劑小分子結構：(a)阿卡波糖 (b)米格列醇 (c)伏格列波糖

(1) 阿卡波糖選用此α-葡萄糖苷酶晶體結構(PDB code: 3W37，如圖1所示)來提取阿卡波糖抑制劑分子.

(2) 米格列醇 結構與葡萄糖相似，能夠可逆地競爭性抑制假單糖α-葡糖苷酶.選擇在此文獻中出現的α-葡萄糖苷酶晶體結構(PDB code: 3L4W，如圖2所示)來提取米格列醇抑制劑分子.

圖2　兩種α-葡萄糖苷酶晶體結構：(a)3W37; (b)3L4W

(3) 伏格列波糖 運用GaussView程序構建抑制劑小分子，再應用Gaussian軟件進行優化，得到能量低、合理的穩定構型.對每種配體分子所有可能的構型進行優化后，選取能量最低的構象作為分子對接中的配體結構.

此外還通過查找其他文獻[7]，獲取了其它三種α-葡萄糖苷酶抑制劑來進行進一步的研究，如圖3所示.這三種結構分別是：表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)和沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG).

圖3　(a)表沒食子兒茶素沒食子酸酯; (b)表兒茶素沒食子酸酯;

1.2設計的抑制劑分子

研究認為這些抑制劑分子的活性差異有可能是由于側鏈官能團的變化引起的.因此，若改變抑制劑分子結構或者改變抑制劑分子的個別官能團，可能對抑制劑分子與蛋白質的結合產生影響.基于這種想法，在原有分子的基礎上設計了兩個可能具有抑制活性的潛在分子，如圖4所示.

如圖4所示，(a)結構是在原有EGCG結構基礎上將編號為1的羥基(如圖3所示)加上氯原子，將其命名為EGCG-Cl.(b)結構是在EGCG結構基礎上將編號為1的羥基換成氨基，將其命名為EGCG-NH2.

為進行進一步研究，將對所有分子結構進行優化，以便產生更合理鍵長和分子間作用力的適合分子結構.

在美國國立生物信息技術中心(NCBI)的PDB數據庫中用protein blast方法搜尋同源性最高的蛋白質序列，發現Gaetano speciale[8]等人正在研究的蛋白質α-葡萄糖苷酶晶體結構(PDB code:5AED).在此結構上，找到其活性位點殘基：Q288、D405、D472、Y508和H537(如圖5所示).本文中所有的抑制劑分子與蛋白質分子的對接若無額外說明，均用此活性位點來進行分子對接.

1.3分子模型的構建和優化

抑制劑分子：應用Gaussian軟件進行分子優化，對每種配體分子所有可能的構型進行優化后，結構鍵長及能量等更加穩定，選取能量最低、結構最合理的構象作為分子對接中的配體結構.

蛋白質分子：該晶體結構是結合體，對接計算之前首先移除晶體結構中的水分子，然后應用Gaussian軟件優化蛋白質分子(5AED)，刪掉復合結構中的配體分子，最后發現其活性位點位于A鏈，于是就只選取處理后的A鏈作為受體結構，如圖5所示.

圖5　分子對接晶體結構：(a)α-葡萄糖苷酶晶體結構(5AED)A鏈；(b)活性位點

1.4分子對接

在進行分子對接時，首先是應用Gaussian軟件對蛋白質分子進行進一步的優化，主要是打開蛋白質后進行加電荷和加極性氫原子等一系列相關處理.完成后，再應用這一軟件中的Ligand模塊對抑制劑分子進行進一步的扭轉角度和去電荷等優化，并且設置配體分子的自由度.抑制劑分子及蛋白質分子進一步處理完成后，應用該軟件對配體抑制劑分子和受體蛋白質分子進行對接模擬.過程中保持受體蛋白質剛性，配體分子中所有可旋轉鍵都通過AutoDock中的Ligand模塊設置為柔性，并且對配體和受體分子添加Auto Dock默認的電荷.并用Grid盒子來確定對接區域，即活性位點殘基所在的區域.蛋白質分子(5AED)選取的活性位點殘基為Q288、D405、D472、Y508和H537.設定特殊的Grid盒子使其能夠完全包含活性位點及其周圍的蛋白區域，最后確定了Grid.盒子的大小為(x-dimension 18，y-dimension 12，z-dimension20)，(x-center 53.462，y-center 23.696，z-center 3.750).

2　結果與討論

2.1現有抑制劑的對接結果及分析

2.1.1阿卡波糖的對接結果與分析

圖6呈現的這種構象就是抑制劑分子阿卡波糖(ACR1001，晶藍色)與蛋白質分子(PDB代碼5AED，晶藍色)經處理后進行對接，然后與原來含有阿卡波糖分子(ACR1001，灰白色)的蛋白質分子(3W37，灰白色)進行序列對比的結果.這是對接最穩定的一種構象，結合能最低，為-6.8 kcal/mol.

圖6　(a)阿卡波糖分子的對接結果(晶藍色)與蛋白質分子3W37(灰白色)的序列對比結構；(b)阿卡波糖分子(球狀)結構平面圖.

在圖中可以看到，抑制劑分子阿卡波糖可以很好的與活性位點結合，與殘基Q288、D405、Y508和H537進行相互作用.其中阿卡波糖分別與殘基Q288和Y508形成氫鍵，鍵長分別為2.62 ?和1.82 ?；與殘基Q288和D405產生靜電作用.在蛋白質分子3W37中，殘基W329形成了一個疏水性的屏障，存在空間位阻，以至于蛋白質分子3W37中的2基團遠離此屏障.而在阿卡波糖分子的對接結果的結構中，與阿卡波糖進行對接的是蛋白質分子5AED.蛋白質分子5AED與蛋白質分子3W37的總體結構不同，周圍的殘基位置和空間形狀也有所不同.所以在蛋白質分子5AED中沒有殘基W329形成的屏障，不存在空間位阻，則使得阿卡波糖對接結構中的1基團可以進入此空間.

2.1.2米格列醇的對接結果與分析

圖7呈現的就是抑制劑分子米格列醇(MIG1001，晶藍色)在與蛋白質分子(5AED，晶藍色)經處理后進行對接，然后與原來含有米格列醇(MIG1001，灰白色)的蛋白質分子(3L4W，灰白色)進行序列對比的結果.這種構象是對接最穩定的一種構象，結合能最低，為-5.3 kcal/mol.

圖7　(a)米格列醇分子的對接結果(晶藍色)與蛋白質分子3L4W(灰白色)的重疊結構； (b)米格列醇分子(球狀)結構平面圖.

在圖中可以看到，抑制劑分子米格列醇分別與殘基D405和Q288產生靜電作用；與殘基Y508形成疏水作用；與殘基Q288、D405和A472相互作用形成了氫鍵.抑制劑分子與殘基Q288形成鍵長為1.83 ?和2.94 ?；與殘基D405形成的鍵長為2.31 ?和2.97 ?；與殘基D472形成的鍵長為2.24 ?.這些氫鍵鍵長較短，形成的構象較穩點，且這些殘基的位置似乎形成了一個特異性的活性口袋，將抑制劑小分子米格列醇包圍在其中間，使米格列醇能更好的與活性位點結合.蛋白質分子5AED與蛋白質分子3L4W的總體結構不同，周圍的殘疾位置和空間形狀也有所不同.

2.1.3伏格列波糖和GCG與晶體結構的對接結果與分析

圖8(a)和圖8(c)呈現的是抑制劑分子伏格列波糖(RES1)與蛋白質分子(5AED)的對接結果，圖8(b)和圖8(d)圖呈現的是抑制劑分子GCG(RES1)與蛋白質分子(5AED)的對接結果.這兩種分子的對接結果均選擇的是結合能最低的構象，伏格列波糖分子的對接結合能分別為-5.9 kcal/mol，GCG分子的對接結合能為-9.0 kcal/mol.

在圖中可以看到，這兩種抑制劑分子的對接結果顯示都能夠很好的進入活性口袋與活性位點相結合.伏格列波糖分子與殘基D405和D472形成靜電作用；與殘基Y508形成疏水作用；與殘基D472形成了氫鍵，鍵長分別為2.22 ?和2.39 ?.GCG分子與殘基Y508形成疏水作用；與殘基D405和D472形成靜電作用；與殘基Q288和H537形成了氫鍵，鍵長分別為1.78 ?和2.84 ?.兩個構象的氫鍵鍵長都比較短，作用較強，可見活性位點尋找的較為準確.

2.2基于設計的抑制劑分子的結果與分析

2.2.1EGCG-Cl分子的對接結果與分析

圖9呈現的是設計的EGCG-Cl分子(RES1，晶藍色)與蛋白質分子5AED的對接結果和EGCG分子(RES1，灰白色)與蛋白質5AED分子的對接結果進行序列對比的結果.研究所選的抑制劑分子與蛋白質分子對接的構象是對接最穩定的一種構象，即結合能最低，EGCG-Cl分子的對接結合能分別為-7.3 kcal/mol，EGCG分子的對接結合能為-9.0 kcal/mol.

圖8　(a)伏格列波糖分子的對接結果； (b)GCG分子的對接結果； (c)伏格列波糖分子(球狀)結構平面圖；(d)GCG分子(球狀)結構平面圖

圖9　(a)EGCG-Cl分子的對接結果(晶藍色)和EGCG分子的對接結果(灰白色)的重疊結構； (b)EGCG-Cl分子(球狀)結構平面圖

在圖中可以看到，設計的EGCG-Cl分子與EGCG分子空間位置大體上是相近的，都能進入活性口袋與活性位點結合.EGCG-Cl分子與殘基Q288、D405和D472形成靜電作用；與殘基Y508形成疏水作用；與殘基H537形成了氫鍵.鍵長為2.85 ?，鍵長較短，結構較穩定.由此可見，此活性位點的選擇較為正確.

2.2.2EGCG-NH2分子的對接結果與分析

圖10呈現的就是設計的EGCG-NH2分子(RES1，晶藍色)與蛋白質分子5AED的對接結果和EGCG分子(RES1，灰白色)與蛋白質分子5AED的對接結果進行序列對比的結果.研究所選的分子與蛋白質對接的構象是對接最穩定的一種構象，即結合能最低，EGCG-NH2分子的對接結合能為-8.7 kcal/mol，EGCG分子的對接結合能為-9.0 kcal/mol..

圖10 (a)EGCG-NH2分子的對接結果(晶藍色)和EGCG分子的對接結果(灰白色)的重疊結；(b)EGCG-NH2分子(球狀)結構平面圖

在圖10中可以看到，設計的EGCG-NH2分子和EGCG分子在空間結構和形狀上具有很高的重疊率.EGCG-NH2分子與殘基D472形成疏水作用；與殘基Y508形成靜電作用；與殘基Q288形成氫鍵，鍵長為2.11 ?.EGCG分子與H537殘基形成氫鍵，鍵長分別為2.85 ?，2.98 ?，3.00 ?，鍵長均較短，結構較穩定.由此可見，此活性位點的選擇較為正確.

2.2.3EGCG-Cl分子和EGCG-NH2分子對接結果的對比分析

圖11呈現的就是設計的EGCG-Cl分子(RES1，晶藍色)與蛋白質分子5AED的對接結果(灰白色)和EGCG-NH2分子(RES1，灰白色)與蛋白質分子5AED的對接結果(晶藍色)的對比結果.這兩種用于對比的構象是分別選取對接最穩定的一種構象，即結合能最低，EGCG-Cl分子對接的結合能為-8.1 kcal/mol，EGCG-NH2分子對接的結合能為-8.9 kcal/mol.

圖11　EGCG-Cl分子的對接結果結構(晶藍色)和EGCG-NH3分子的對接結果(灰白色)的重疊結構

在圖11中可以看到，設計的EGCG-Cl和EGCG-NH2分子跟抑制劑分子EGCG一樣，都能很好的進入活性口袋與活性位點結合，但這兩個分子的位置沒有完全重疊在一起，稍有偏差.EGCG-Cl分子對接的結果和EGCG分子與蛋白質分子5AED的對接結果基本相同.EGCG-Cl分子對接結果上連接Cl原子的羥基和EGCG分子對接結果上的羥基結合位置一樣.EGCG-NH2分子與殘基Q288和H537形成了氫鍵.殘基Q288與EGCG-NH2分子中的氨基形成氫鍵的鍵長為2.22 ?；殘基H537與EGCG-NH2分子形成氫鍵的鍵長為2.99 ?和3.00 ?.EGCG-NH2分子自身的羥基也與氨基形成了氫鍵，鍵長為2.34 ?.因此包含氨基的苯環與之前的相比，進行了一個180度的扭轉，所以對比的位置產生了一定的偏差.

3　結論

本文主要采用分子對接的方法，研究了幾種α-葡萄糖苷酶抑制劑與α-葡萄糖苷酶的結合模式和作用機制，明確了可能的結合位點.本文基于蛋白質分子5AED的晶體結構，找到其活性位點殘基為Q288、D405、D472、Y508和H537.阿卡波糖和米格列醇羥基上的氫與活性位點殘基形成多個氫鍵，具有較強的相互作用；伏格列波糖、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)和設計的兩種分子都能很好的進入活性口袋，可以得出抑制劑分子所處的疏水環境和靜電作用對抑制劑的結合有穩定作用.在最后通過相關的實驗模擬驗證，認為用上述介紹的分子優化對接方法來進行相關實驗是具有可行性的，為實驗上α-葡萄糖苷酶抑制劑的研究提供了理論基礎.

[1]李平平. 抗糖尿病藥物的臨床用藥探究[J].糖尿病新世界，2016, 1: 22-24.

[2]胡一宇, 黃麗華.糖尿病患者飲食教育的研究現狀[J].中華護理雜志，2013, 48(6): 555-557.

[3]陳名道. 波動性高血糖與糖尿病并發癥[J].國際內分泌代謝雜志，2006, 5: 312-314.

[4]李玉萍, 白冰, 葉軍, 等. α-葡萄糖苷酶抑制劑的制備和活性研究進展[J].食品科學,2008, 29(9): 617-619.

[5]Tagami T, Yamashita K, Okuyama M, et al. Molecular basis for the recognition of long-chain substrates by plant α-glucosidases[J].Journal of Biological Chemistry ,2013, 6(28): 19296-19303.

[6]Sim L, Jayakanthan K, Mohan S, et al. New glucosidase inhibitors from an ayurvedic herbal treatment for type 2 diabetes:structures and inhibition of human intestinal maltase-glucoamylase with compoundsfrom salacia reticulata[J].Biochemistry,2010, 49: 443-451.

[7]范莉, 王業玲, 唐麗. 天然來源α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選方法的研究進展[J].天然產物研究與開發,2016, 28: 313-321.

[8]Speciale G, Jin Y, Davies G J, et al. YihQ is a sulfoquinovosidase that cleaves sulfoquinovosyl diacylglyceride sulfolipids[J].Nature Chemical Biology,2016, 2(15): 215-218.

[責任編輯：周峰巖]

Mechanism Study of Alpha Glycosidase Inhibitors and Glycosidase

WANG wena，WANG Jin-hua，ZHANG Xiao-kanga, ZHAO Xiang-yub

(a.School of Chemical Engineering and Material Science;b.School of Art and Design,Zaozhuang University, Zaozhuang 277160,China)

Alpha glycosidase is a key enzyme that hydrolyzes carbohydrates, and the inhibition of the alpha glycosidase activity can suppress postprandial hyperglycemia. Inhibitors of alpha glycosidasecan defer absorption of carbohydrate in intestine, which are mature drugs in the treatment of diabetes. In order to discover new alpha glycosidase inhibitor with better therapeutic effects, it is very important to study the interaction between alpha glycosidase inhibitor and alpha glycosidase. Here, the method of molecular docking is adopted to investigate the binding modes and interaction mechanisms. Besides, two potential alpha glycosidase inhibitors are designed based on the docking results, which might provide theoretical information for the drug design on the experiment.

diabetes; glucosidase; inhibitor; molecular docking; active sites

2016-07-05

山東省高等學校科技發展計劃項目(項目編號：J13LD04).

王文(1978-)，男，山東棗莊人，棗莊學院化學化工與材料科學學院副教授,理學碩士，主要從事生物小分子與酶體系作用機制研究.

G633.8

A

1004-7077(2016)05-0127-08