抗菌金屬材料抗菌性能檢測(cè)方法研究

葉德萍，周李華，王　智，馬麗俠，譚和平

（中國(guó)測(cè)試技術(shù)研究院，四川 成都 610021）

抗菌金屬材料抗菌性能檢測(cè)方法研究

葉德萍，周李華，王智，馬麗俠，譚和平

（中國(guó)測(cè)試技術(shù)研究院，四川 成都 610021）

為建立檢測(cè)抗菌金屬材料的抗菌性能的方法。分別用ASTM E2149-13a法和ISO 22196——2011法對(duì)抗菌金屬的抗菌性能和適用性進(jìn)行比對(duì)研究，得出這兩種方法都不太適合抗菌金屬材料的抗菌性能檢測(cè)。提出適宜于抗菌金屬及其制品的抗菌性能檢測(cè)方法：采用貼膜法，抗菌金屬材料與菌液的作用時(shí)間為2h。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明：該方法重復(fù)性好、再現(xiàn)性佳，3種不同抗菌劑處理的金屬材料抗菌率，其重復(fù)性分別為5.5%、5.6%和2.5%，同種抗菌劑處理的金屬材料抗菌率的再現(xiàn)性為5.5%，說(shuō)明該方法能應(yīng)用于抗菌金屬及相關(guān)材料抗菌性能檢測(cè)。

抗菌性能；金屬；檢測(cè)方法；抗菌材料

0　引　言

隨著社會(huì)生活資料的不斷豐富，人居環(huán)境的安全性及材料的抗菌功能日益受到重視；因此，新一代兼有抗菌性能的產(chǎn)品應(yīng)運(yùn)而生，在日常家具、廚具及衛(wèi)生用品方面展示出廣闊的市場(chǎng)前景［1］。抗菌材料是指那些具有抑菌和殺菌性能的功能材料，與普通材料相比，抗菌產(chǎn)品具有衛(wèi)生自潔功能，可免去許多清潔工作，能有效避免細(xì)菌傳播，減少交叉感染，對(duì)改善人們生活質(zhì)量，保護(hù)健康具有重要意義［2］。

當(dāng)前對(duì)于“抗菌材料”概念的過(guò)度炒作讓產(chǎn)品真假難辨，產(chǎn)品是否使用抗菌材料無(wú)從判斷，技術(shù)指標(biāo)無(wú)法統(tǒng)一，技術(shù)質(zhì)量監(jiān)督和管理很困難，消費(fèi)者的合法權(quán)益難以得到保障，對(duì)抗菌制品存在信任危機(jī)。所謂的抗菌材料是否真正具有抗菌效果，抗菌性能究竟如何？建立一種抗菌材料的抗菌性能檢測(cè)方法尤為重要。一方面可以規(guī)范市場(chǎng)，提升產(chǎn)品品質(zhì)，另一方面則防止消費(fèi)者掉入宣傳的套路中［3］。

我國(guó)雖有SN/T 2399——2010《抗菌金屬材料評(píng)價(jià)方法》［4］，但該標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容完全參照J(rèn)IS Z 2801——2000《抗菌測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)》［5］進(jìn)行，JIS Z 2801——2000只有紡織品和塑料的抗菌性能檢測(cè)方法。

本研究選擇可用于抗菌金屬抗菌性能檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)ASTM E2149-13a［6］和ISO 22196——2011［7］進(jìn)行復(fù)現(xiàn)，在此基礎(chǔ)上研究建立實(shí)驗(yàn)室方法，并對(duì)該方法進(jìn)行方法學(xué)考察，得出適合抗菌金屬材料的抗菌性能檢測(cè)方法。

1　材料及方法

1.1試劑、材料和菌株

營(yíng)養(yǎng)肉湯、平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限公司）；緩沖液（0.3 mmol/L KH2PO4，自制）；覆蓋膜（聚乙烯薄膜，標(biāo)準(zhǔn)尺寸為（40±2）mm×（40±2）mm、厚度為0.05～0.10 mm，用70%乙醇溶液浸泡1min，再用無(wú)菌水沖洗，自然干燥）；菌種（大腸埃希氏菌Escherichia coli，ATCC 25922）。

1.2儀器和設(shè)備

培養(yǎng)箱（上海智誠(chéng)ZSD-1270）；高壓蒸汽滅菌器（日本Tomy ES-315）；紫外分光光度計(jì)（日本島津UV-1700）；漩渦震蕩儀（廈門(mén)XW-80A）；水浴鍋（上海精宏DK-8B）。

1.3菌種活化與菌懸液制備

將E.coli保藏菌轉(zhuǎn)接到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，在（37±1）℃下培養(yǎng)24 h，后每天轉(zhuǎn)接1次，不超過(guò)2周。試驗(yàn)時(shí)應(yīng)采用連續(xù)轉(zhuǎn)接2次后的新鮮細(xì)菌培養(yǎng)物（24h內(nèi)轉(zhuǎn)接的）。

用接種環(huán)從營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上取少量（刮1～2環(huán)）新鮮細(xì)菌，加入營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)18 h，菌液用磷酸鹽緩沖液稀釋，直至菌液在475nm的吸光度為0.28±0.02；菌液再用磷酸鹽緩沖液稀釋1000倍，作為工作菌懸液。

1.4樣品

金屬片：分別采用表面經(jīng)過(guò)抗菌處理（抗菌樣品）和未經(jīng)抗菌處理（對(duì)照樣）的直徑5 cm圓形金屬片。

1.5抗菌性能檢測(cè)

1.5.1ASTM E2149-13a

分別將抗菌表面積約為25.8 cm2的抗菌金屬樣品和對(duì)照金屬樣品，切割成表面積0.5cm2的小片，放入250 mL滅菌三角燒瓶中，每個(gè)燒瓶加入（50± 0.5）mL工作菌懸液。并在另一個(gè)空三角燒瓶中加入（50±0.5）mL菌懸液作為菌液空白對(duì)照，立即對(duì)空白對(duì)照的菌液作梯度稀釋并利用平板計(jì)數(shù)法對(duì)菌的含量計(jì)數(shù)，稀釋過(guò)程不能超過(guò)5min。

將3個(gè)三角燒瓶放入恒溫振蕩器，用最大的震蕩速度震蕩（60±5）min，立即對(duì)每瓶菌液梯度稀釋至1000倍，并用平板計(jì)數(shù)法對(duì)每個(gè)梯度做菌落計(jì)數(shù)，每個(gè)梯度做3個(gè)平行，（36±1）℃培養(yǎng)24h。選擇30～300菌落數(shù)的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，3個(gè)平行菌落數(shù)的平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)即為每毫升菌液的菌數(shù)。

1.5.2ISO 22196——2011

用平板計(jì)數(shù)法對(duì)工作菌懸液計(jì)數(shù)并作為菌液空白，同時(shí)分別取菌懸液0.2mL滴加在對(duì)照金屬片和抗菌金屬片上，對(duì)照金屬片做6個(gè)平行，每種抗菌金屬片樣品做3個(gè)平行，用滅菌鑷子夾起滅菌覆蓋膜分別覆蓋在對(duì)照金屬片和抗菌金屬片上，確保鋪平，使菌均勻接觸樣品，且菌液不要超過(guò)覆蓋膜邊緣。立即回收3個(gè)對(duì)照金屬片上的菌，用20mL磷酸緩沖液反復(fù)沖洗（最好用鑷子夾起薄膜沖洗）并收集液體，將收集液充分搖勻后，作梯度稀釋，取適宜稀釋的液體傾注平板計(jì)數(shù)瓊脂，在（36±1）℃下培養(yǎng)24 h后菌落計(jì)數(shù)，作為對(duì)照樣0h的菌落數(shù)。將剩余的3片對(duì)照金屬片和抗菌金屬片小心置于滅菌平皿中，在（36±1）℃、相對(duì)濕度大于90%條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)24h。培養(yǎng)完成后取出培養(yǎng)的樣品，采用相同方法沖洗金屬片及覆蓋膜并對(duì)收集液做菌落計(jì)數(shù)。

1.5.3本文改進(jìn)方法

同1.5.2，對(duì)照金屬片做9個(gè)平行，0，1，2 h的各培養(yǎng)3個(gè)并作菌落計(jì)數(shù)；每種抗菌金屬片樣品做6個(gè)平行，3個(gè)培養(yǎng)1h，3個(gè)培養(yǎng)2h并作菌落計(jì)數(shù)。

2　試驗(yàn)結(jié)果及分析

ASTM E2149-13a方法的抗菌性能檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，將抗菌金屬片做了各種抗菌處理，但是幾乎沒(méi)有抗菌效果，雖然該方法提出可用于表面有抗菌劑的固體（如金屬片，塑料，玻璃，芯片，或類似堅(jiān)硬表面的材質(zhì)），但從本研究看來(lái)該方法不適合抗菌金屬片的檢測(cè)。

ISO 22196——2011法的抗菌性能檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，樣品在培養(yǎng)了24 h后，菌液基本干了，因此洗脫液培養(yǎng)后都無(wú)菌落生長(zhǎng)，只有對(duì)照樣-3有9CFU，乘以稀釋倍數(shù)20，計(jì)算出該金屬片上的菌為180CFU，而其他金屬片則是＜20CFU。基于此在金屬片下墊一個(gè)無(wú)菌的材料作支撐，再在培養(yǎng)皿上滴5mL滅菌水，以保持平皿內(nèi)的濕度，培養(yǎng)24h，此時(shí)金屬片與覆蓋膜之間的菌液未干，洗脫后作菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3，培養(yǎng)24h后從金屬片和覆蓋膜上洗脫下來(lái)的菌太多，有些甚至無(wú)法計(jì)數(shù)，說(shuō)明平皿內(nèi)濕度太高，又造成了菌的迅速增殖。

表1　ASTM E2149-13a法的抗菌性能檢測(cè)結(jié)果1）

表2　ISO 22196——2011法的抗菌性能檢測(cè)結(jié)果1）

表3　ISO 22196——2011法的抗菌性能檢測(cè)結(jié)果（裝金屬片的平皿內(nèi)滴加滅菌水）1）

表4　本文改進(jìn)方法的抗菌性能檢測(cè)結(jié)果1）

由于ISO 22196——2011法培養(yǎng)需要24 h，要保證洗脫的回收率（對(duì)照樣0h的菌落數(shù)與菌液空白菌落數(shù)的百分比不能低于75%，對(duì)照樣品接觸24h后的菌落計(jì)數(shù)應(yīng)不低于0h菌落計(jì)數(shù)的1/100）和菌液培養(yǎng)24h不干，試驗(yàn)的難度很大。基于此，將培養(yǎng)時(shí)間從24h縮短到了1h和2h，考察短時(shí)作用下抗菌金屬片的抗菌效果；若短時(shí)作用下，抗菌金屬片仍能達(dá)到很好的抗菌效果，則說(shuō)明該金屬片的抗菌性能很好，而且也減少了試驗(yàn)的難度，增加了試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。由表4可以看出，處理樣隨著處理時(shí)間改為1～2 h，抗菌效果有提高。對(duì)照樣在1h時(shí)，菌落數(shù)下降不明顯，有些還有略微上升，這是因?yàn)榫幸欢ǔ潭鹊脑鲋超F(xiàn)象，而在2 h時(shí)菌落數(shù)下降很明顯，可能是隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，水分蒸發(fā)，細(xì)菌的死亡速度超過(guò)了增殖速度。

微生物在相同的條件其生長(zhǎng)情況都有可能不同，為滿足試驗(yàn)的重復(fù)性和再現(xiàn)性，每個(gè)樣品至少要做3個(gè)以上平行，每個(gè)數(shù)據(jù)的相對(duì)偏差不能大于15%。本研究中每個(gè)樣品（對(duì)照和抗菌樣）都做了3個(gè)平行，包括每種接觸時(shí)間都分別做了3個(gè)平行，但I(xiàn)SO 22196——2011法的重復(fù)性都不好，只有本文改進(jìn)的方法滿足要求，1 h的抗菌率相對(duì)偏差為7.4%、5.5%和6.0%；2 h抗菌率相對(duì)偏差為5.5%、5.6%和2.5%；因此對(duì)抗菌效果最好的一種處理方法的抗菌材料做了再現(xiàn)性試驗(yàn)。3次獨(dú)立的試驗(yàn)，1 h的抗菌率分別為47%、32%和41%，相對(duì)偏差7.55%，未超過(guò)15%；2 h的抗菌率分別為71%、61%和59%，相對(duì)偏差5.48%也未超過(guò)15%，說(shuō)明同種抗菌劑處理的金屬材料抗菌率的再現(xiàn)性為5.5%。

由上可知，培養(yǎng)2h比1 h的抗菌率高，基本能達(dá)到70%，而且2 h時(shí)菌液也未干，因此將2 h作為抗菌金屬抗菌性能檢測(cè)之反應(yīng)時(shí)間（即作用時(shí)間），既能達(dá)到客觀評(píng)價(jià)抗菌制品的抗菌功能的目的，又能節(jié)省大量時(shí)間。解學(xué)魁［8］的研究也證明很多抗菌制品在與菌作用2h后抑菌率不再隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯增加，如果延長(zhǎng)作用時(shí)間，抑菌率雖可能有一定的提高，但卻大大增加了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，同時(shí)也為實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量控制提高了難度。

3　結(jié)束語(yǔ)

ASTM E2149-13a將抗菌金屬片做了各種抗菌處理，但是幾乎沒(méi)有抗菌效果，雖然該標(biāo)準(zhǔn)提出可用于表面有抗菌劑的固體（如金屬片，塑料，玻璃，芯片，或類似有堅(jiān)硬表面的材質(zhì)）檢測(cè)，但從本研究看來(lái)該方法不適合抗菌金屬片，而本文改進(jìn)方法相比ISO 22196——2011法時(shí)間縮短至2h，但抗菌率達(dá)到60%～70%。說(shuō)明本文改進(jìn)方法更適合用于抗菌金屬片的抗菌性能檢測(cè)。

［1］季君暉，史維明.抗菌材料［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003：46-60.

［2］劉秀英，呂斌，郭紅蓮，等.我國(guó)抗菌產(chǎn)品性能檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)體系現(xiàn)狀［J］.中國(guó)人造板，2009（8）：27-30.

［3］張曉，魯建國(guó)，劉皓男.家電產(chǎn)品抗菌、除菌檢測(cè)方法綜述［C］∥2012年中國(guó)家用電器技術(shù)大會(huì)集，2012：621-623.

［4］抗菌金屬材料評(píng)價(jià)方法：SN/T 2399—2010［S］.北京：中國(guó)質(zhì)檢出版社，2010.

［5］Antimicrobial Products-Test for Antimicrobial Activity and Efficacy：JIS Z 2801—2000［S］.2000.

［6］Standard Test Method for Determining the Antimicrobial ActivityofimmobilizedAntimicrobialAgentsUnder Dynamic Contact Conditions：ASTM E2149-13a［S］.West Conshohocken：ASTM International，2010.

［7］Plastics-Measurement of antibacterial activity on plastics surfaces：ISO 22196—2011（E）［S］.2011.

［8］抗菌制品的抑菌效果檢測(cè)方法研究［J］.中國(guó)公共衛(wèi)生，2001，17（7）：634-635.

（編輯：莫婕）

Study on detection method of antibacterial properties of antibacterial metallic materials

YE Deping，ZHOU Lihua，WANG Zhi，MA Lixia，TAN Heping
（National Institute of Measurement and Testing Technology，Chengdu 610021，China）

The purpose of this paper is to design a detection method for antibacterial properties of antibacterial metallic materials.The antibacterial properties were detected and the applicability thereof was comparatively studied with both the ASTM E2149-13a and ISO 22196——2011 methods.The outcome suggests that the two methods were unsuitable for testing the antibacterial properties of antibacterial metallic materials.Then，a scientific and reasonable detection method was put forward.First，the antibacterial metallic materials and bacterial liquid were mixed with the sticking membrane method to react for 2 hours.It is proved from the test results that this method is stable and highly reproductive.The repeatability of the antibacterial rates of metallic materials treatedby three different kinds of antibacterialagents is5.5%，5.6%and2.5% respectively.The reproducibility of the same kind of antibacterial agent is 5.5%.It suggests that the proposed method can be used to detect the antibacterial properties of antibacterial metal and related materials.

antibacterial property；metal；detection method；antibacterial materials

A

1674-5124（2016）05-0066-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2016.05.014

2016-02-03；

2016-03-13

2015國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2015BAK45B00，2015BAK45B01）

葉德萍（1983-），女，四川鹽源縣人，助理研究員，主要從事微生物研究。

譚和平（1957-），男，重慶市人，研究員，享受國(guó)務(wù)院政府津貼專家，主要從事生物化學(xué)研究。